SB2301

Biología de las comunicaciones volumen 6, Número de artículo: 300 (2023) Citar este artículo

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Las gotas de lípidos (LD) están involucradas en varios eventos biológicos en las células junto con su función principal como centro de almacenamiento de lípidos neutros. La acumulación excesiva de LD está altamente correlacionada con varias enfermedades, incluidas las enfermedades metabólicas. Por lo tanto, una comprensión básica del mecanismo molecular de la degradación de LD sería beneficiosa tanto para la investigación académica como industrial. La lipofagia, un mecanismo de autofagia selectiva/proceso de degradación de LD, ha ganado una mayor atención en la comunidad científica. En este documento, buscamos dilucidar un nuevo mecanismo de lipofagia utilizando la molécula pequeña que degrada LD, SB2301, que activa la lipofagia mediada por ubiquitina. Usando un método de identificación de objetivos sin etiquetas, revelamos que la etanolamina-fosfato citidililtransferasa 2 (PCYT2) es una posible proteína objetivo de SB2301. También demostramos que aunque SB2301 no modula la función de PCYT2, induce la translocación celular de PCYT2 a la superficie de LD y aumenta espacialmente la proporción de fosfatidiletanolamina (PE)/fosfatidilcolina (PC) de la membrana de LD, provocando la coalescencia de LD, lo que lleva a la activación del proceso de lipofagia para mantener la homeostasis energética.

Las gotitas de lípidos (LD) son orgánulos especializados que almacenan ácidos grasos libres celulares (FFA) como lípidos neutros, como triacilglicerol (TG) o ésteres de esterol (SE), para evitar la lipotoxicidad de los FFA1,2. En las LD, los lípidos neutros están rodeados por fosfolípidos como la fosfatidilcolina (PC) y la fosfatidiletanolamina (PE)3, y proteínas de superficie como la familia de las perilipinas4 y las lipasas5. Las células generan o degradan LD dinámicamente en respuesta a cambios ambientales para mantener la homeostasis energética y regular el metabolismo de los lípidos6.

Las lipasas en la superficie de LD degradan principalmente los lípidos neutros cuando las células requieren la degradación de LD7,8. Singh et al. informaron que las LD podrían ser un sustrato de la autofagia selectiva, llamada lipofagia, que secuestra la LD dentro de los autofagosomas en condiciones de inanición9. La comunidad de investigación biomédica ha estado trabajando en el mecanismo de lipofagia para revelar varias funciones de los LD más allá del almacenamiento de lípidos neutros10, como la modulación del estrés celular11,12, la regulación funcional de proteínas13,14 y el almacenamiento de otras biomoléculas15,16. Por lo tanto, estudiar el mecanismo regulador de LD puede proporcionar información valiosa para definir las vías biológicas subyacentes debido a su relevancia en los campos de biología química y descubrimiento de fármacos. Además, recientemente se ha enfatizado la relevancia fisiológica de los LD en las enfermedades metabólicas. La acumulación de LD en el músculo y el hígado es un sello distintivo de las enfermedades metabólicas, incluidas la esteatosis17,18, la diabetes tipo 219,20 y la aterosclerosis21,22. Así, la lipofagia surge como una nueva estrategia para el tratamiento de este tipo de enfermedades, especialmente la esteatosis y las enfermedades hepáticas23,24,25.

Además, el enfoque basado en el fenotipo ha sido una estrategia importante para descubrir nuevas entidades moleculares con nuevos modos de acción. En este estudio, realizamos una detección de alto rendimiento basada en imágenes para monitorear la cantidad y el tamaño de los LD celulares como fenotipos cruciales en las células vivas. Además, evaluamos una nueva molécula pequeña, SB2301, para explorar la lipofagia mediada por ubiquitina como un nuevo mecanismo regulador de las LD. Usando SB2301, revelamos un nuevo mecanismo de activación de lipofagia que induce la degradación de LD al alterar espacialmente la composición lipídica de las membranas de LD.

Primero, realizamos un cribado fenotípico basado en imágenes de LD celulares en células vivas para identificar moduladores potenciales de LD celulares. Previamente, informamos sobre la sonda fluorogénica, SF44, que tiene una propiedad de activación hidrófoba selectiva de LD en células vivas26. También demostramos la aplicación de SF44 a las imágenes de fluorescencia de una manera de alto rendimiento con un excelente factor Z'27. El sistema de monitoreo de LD basado en SF44 que utiliza SF44 permite la observación en tiempo real de la dinámica de LD celular sin necesidad de pasos de lavado. Por lo tanto, aplicamos este sistema de monitoreo de LD de alto contenido en células vivas para identificar nuevas entidades químicas que carecen de toxicidad celular con una influencia mínima de otros factores externos.

Anteriormente informamos sobre una serie de compuestos que reducían las DL28 celulares. Estos compuestos se derivaron de una biblioteca privilegiada de síntesis orientada a la diversidad basada en subestructuras (pDOS) diseñada con un resto isoxazol central y su sustitución en las posiciones C3 y C5 con estructuras privilegiadas, como indol, benzopirano, quinolina y pirimidina (Fig. . 1). Entre ellos, solo los derivados de isoxazol sustituidos con 3-(quinolin-6-il)fenol mostraron una excelente eficacia para la reducción de la LD celular. Sin embargo, estos compuestos mostraron cierto grado de citotoxicidad. Para abordar este problema, reemplazamos bioisotéricamente el isoxazol con 1,2,3-triazol como una modificación estructural para evitar la citotoxicidad y mejorar las actividades de reducción de LD deseadas29. Con isoxazoles sustituidos con 3-(quinolin-6-il)fenol como punto de partida, construimos una biblioteca de 1,2,3-triazoles 1,4-disustituidos que contiene estructuras privilegiadas de quinolina para estudios de relación estructura-actividad (SAR) ( Nota complementaria 1). Se diseñó y sintetizó una serie de 17 análogos basados ​​en andamios de 3-(quinolin-6-il)fenol y 1,2,3-triazol (Nota complementaria 2). Como se muestra en el Esquema complementario 1, la alquinilquinolina se sometió a una reacción de clic catalizada por cobre (I) con varias azidas aromáticas en presencia de CuSO4 · H2O y ascorbato de sodio.

La actividad de reducción de LD de estos análogos (1–20) se evaluó inicialmente en células HeLa de cáncer de cuello uterino humano a una concentración fija (10 μM cada una) para determinar la eficacia de la reducción de LD. Además, la potencia se determinó midiendo la mitad de la concentración inhibitoria máxima (IC50) (Tabla complementaria 1). Los compuestos con alta citotoxicidad y baja solubilidad en agua se excluyeron durante la selección fenotípica de alto contenido. Con base en nuestro estudio SAR, confirmamos que el 1-(2-trifluorometil fenil)-4-(3-hidroxifenilquinolona)triazol (4) mostró la actividad reductora de LD más potente entre nuestros derivados y se denominó SB2301 (Fig. 1A) . Observamos una actividad de reducción de LD dependiente de la dosis en células HeLa con un IC50 de 4.4 μM a las 24 h después del tratamiento con SB2301 (Fig. 1B, C). Aunque SB2301 mostró cierta citotoxicidad a altas concentraciones (Fig. 1D), usamos SB2301 en las concentraciones en las que esto no es un problema, lo que ofrece una ventana de oportunidad para los estudios biológicos posteriores. También observamos un patrón similar de reducción de LD en células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano (Fig. 2A complementaria) y células AML12 de hepatocitos de ratón (Fig. 2B complementaria). De acuerdo con la reducción de los LD celulares, el contenido de triglicéridos (TG) celulares se redujo de manera dependiente de la dosis (Fig. 1E). Con base en estos hallazgos, realizamos un estudio adicional para determinar el mecanismo por el cual SB2301 redujo los LD celulares.

Una estructura química de SB2301 (4). B Imágenes de fluorescencia LD representativas capturadas durante el cribado fenotípico. C La cuantificación del recuento de LD celular en células HeLa tras el tratamiento con varias dosis de SB2301 durante 24 h. Todos los datos se muestran como media ± desviación estándar (DE). D Curvas dosis-respuesta de viabilidad celular tras el tratamiento con SB2301 durante los tiempos indicados en células HeLa. Todos los datos se muestran como la media ± SD. Resultados de la cuantificación de E TG tras el tratamiento con SB2301 durante 24 h en células HepG2. Todos los datos se representan como diagramas de puntos con la media ± DE, (n = 3). Los datos se analizaron usando una prueba t no pareada. **P = 0,0068 frente a dimetilsulfóxido (DMSO), ##P = 0,0029 frente a DMSO.

La LD celular puede reducirse previniendo su formación (vía anabólica) o promoviendo su degradación (vía catabólica). No observamos cambios drásticos en la expresión de genes relacionados con la biosíntesis de lípidos tras el tratamiento con SB2301 mediante análisis de qPCR (Fig. 3A complementaria) y proteínas que regulan la síntesis de TG/CE mediante análisis de transferencia Western (Fig. 3B complementaria). Además, la reducción de LD mediada por SB2301 no fue inhibida por el tratamiento conjunto con Orlistat, un inhibidor de lipasa común (Fig. 3C complementaria). En cambio, confirmamos que el tratamiento con SB2301 activó la degradación de LD a través de la lipofagia, un proceso autofágico selectivo. Durante la progresión de la autofagia, la proteína 1 A/1B-cadena ligera 3 (LC3) I asociada a microtúbulos se lipida para convertirse en LC3 II en la superficie del fagóforo. Según el análisis de transferencia Western, la conversión de LC3 I a II se produjo tras el tratamiento con SB2301 de manera dependiente tanto de la dosis como del tiempo (Fig. 2A, B). Cuando redujimos el gen 5 relacionado con la autofagia (ATG5), una de las proteínas clave para el alargamiento del fagóforo de la autofagia, la conversión de LC3 I a II mediada por SB2301 se eliminó por completo (Fig. 2C). Luego examinamos el flujo autofágico mediado por SB2301 tras el tratamiento con bafilomicina A1 (Baf), un modulador conocido de H+-ATPasa de tipo vacuolar, que inhibe la degradación autolisosomal de la carga autofágica al prevenir su acidificación, bloqueando así el flujo autofágico de etapa tardía. Observamos una mayor acumulación de LC3 II tras el tratamiento conjunto con SB2301 y Baf de manera dependiente de la dosis (Fig. 2D). También realizamos imágenes de células vivas con la proteína mCherry-GFP-LC3 (Fig. 4 complementaria) 30; Debido a la propiedad de extinción intrínseca de GFP en condiciones ácidas, pudimos determinar si las proteínas LC3 fusionadas con mCherry-GFP están ubicadas en autofagosomas (neutros) o autolisosomas (ácidos) simplemente monitoreando los cambios en la señal de GFP mientras rastreamos la proteína LC3 con una señal de mCherry independiente del pH. La rapamicina (Rap) activa la autofagia al inhibir la vía de señalización del complejo de rapamicina 1 (mTORC1) de los mamíferos e inducir la formación de puntos rojos debido a la extinción de la señal de GFP en los autolisosomas ácidos. Por el contrario, el tratamiento con Baf detiene el flujo autofágico en etapa tardía al bloquear la acidificación lisosomal, lo que se confirmó mediante la formación de puntos amarillos a través de imágenes de células vivas con mCherry-GFP-LC3. Con base en nuestros experimentos de control con el inductor de autofagia (Rap) y el inhibidor (Baf), SB2301 fenocopió el inductor de autofagia, lo que confirma que SB2301 activa la autofagia.

Un análisis de transferencia Western con varias dosis de SB2301, rapamicina (Rap, 2 μM) y bafilomicina A1 (Baf, 20 nM) tratadas en células HepG2 durante 12 h. Análisis de transferencia Western con 10 μM de SB2301 durante los tiempos indicados (B), con tratamiento con SB2301 en la condición de eliminación del gen 5 relacionado con la autofagia (Atg5), seguido de tratamiento con SB2301 durante 9 h (C), y con tratamiento con SB2301 en ausencia y presencia de 5 nM de Baf durante 6 h (D). E Imágenes representativas de fluorescencia de células vivas de LC3 (rojo, mCherry) y LD (verde, SF44) en células HeLa transfectadas con mCherry-LC3 tras el tratamiento con rapamicina (1 μM), cloroquina (10 μM) y SB2301 (5 μM) para 12 horas F Imágenes representativas de fluorescencia de células vivas de lisosomas (rojo, lysotracker) y LD (verde, SF44) tras el tratamiento con rapamicina (1 μM) y SB2301 (10 μM) en células HeLa durante 12 h. G Imágenes de inmunofluorescencia representativas de ubiquitina (rojo) y LD (verde, BODIPY 493/503) en células HepG2 tras el tratamiento con SB2301 (10 μM) durante 12 h. Después de fijar las células, la ubiquitina se marcó con un anticuerpo anti-ubiquitina y la LD se tiñó con BODIPY 495/503. H Cuantificación de la intensidad de la fluorescencia de las imágenes capturadas en G. Las imágenes se seleccionaron al azar de triplicados biológicos (n = 21 de DMSO, n = 32 de SB2301). Las señales de ubiquitina citoplasmática se restaron como fondo y se calculó la relación de señal fluorescente (ubiquitina/LD) en cada píxel. Todos los datos se representan como diagramas de puntos con la media ± DE. Los datos se analizaron usando una prueba t no pareada. ***P = 0,0001.

Luego monitoreamos la ubicación celular de LD, LC3 (autofagosoma) y lisosomas en el tratamiento con SB2301 para determinar si los LD se usaron como sustratos de autofagia. Como se muestra en la Fig. 2E y la Fig. 5A complementaria, Raf (un activador de autofagia, no un activador de lipofagia) no indujo que las LD estuvieran rodeadas por LC3 como selección de sustrato de autofagosoma mediada por LC3. Mientras tanto, con el tratamiento con cloroquina (un inhibidor de la degradación lisosomal), las LD quedaron atrapadas en el autofagosoma. SB2301 indujo la formación de autofagosomas a través de la activación de la autofagia, lo que fue consistente con la señal fluorescente mejorada de LC3. Además, el tratamiento con SB2301 aumentó la colocalización de LD con proteínas LC3 más que el control de dimetilsulfóxido (DMSO) junto con una reducción significativa en las señales de fluorescencia de LD. En conjunto, nuestros resultados indican que SB2301 indujo el secuestro de LD completos o parciales en los autofagosomas, que eventualmente se fusionan con los lisosomas para hidrolizar los LD (Fig. 2F y Fig. 5B complementaria). Para determinar si SB2301 induce la autofagia en orgánulos que no sean LD celulares, medimos el contenido de ADN mitocondrial en el tratamiento con SB2301 y confirmamos que el contenido mitocondrial no se vio afectado por este tratamiento (Fig. 6 complementaria), lo que indica que SB2301 redujo selectivamente los LD celulares al inducir lipofagia.

La ubiquitinación participa activamente en el reconocimiento de cargas de autofagia selectivas31, como las mitocondrias32,33, los agregados de proteínas34, los peroxisomas35 y los patógenos36. Sin embargo, la lipofagia mediada por ubiquitina aún no se ha informado. Para determinar si la reducción de LD mediada por SB2301 a través de la lipofagia está regulada por un mecanismo mediado por ubiquitina, realizamos imágenes de inmunofluorescencia contra ubiquitina en células HepG2. Como se muestra en la Fig. 2G, las Figs. complementarias. 7, 8, se produjo una ubiquitinación sustancial en la superficie de LD con el tratamiento con SB2301 en comparación con el tratamiento con DMSO. Además, cuando cuantificamos la proporción de ubiquitina a la señal de LD después de la sustracción de fondo con señales de ubiquitina citoplásmica, la proporción fue significativamente mayor en condiciones tratadas con SB2301 (Fig. 2H), lo que confirma que las proteínas de superficie de LD se ubiquitinaron más selectivamente que las proteínas citoplasmáticas. tras el tratamiento con SB2301.

Para investigar el mecanismo subyacente de SB2301 en la lipofagia, llevamos a cabo un estudio de identificación de objetivos utilizando la diferencia de fluorescencia basada en el cambio de estabilidad térmica en electroforesis en gel bidimensional (TS-FITGE). Esta técnica se basa en cambios característicos en la estabilidad de la proteína inducidos por desnaturalización térmica cuando la proteína interactúa específicamente con su ligando37. Brevemente, las células tratadas con DMSO y SB2301 se sometieron a choque térmico a temperaturas crecientes y los lisados ​​resultantes se conjugaron químicamente con ésteres de Cy3-N-hidroxisuccinimida y Cy5-N, respectivamente. A partir de entonces, dos proteomas (marcados fluorescentemente con Cy3 y Cy5) de cada condición de temperatura se combinaron y analizaron mediante electroforesis en gel 2D. Finalmente, el análisis basado en imágenes de fluorescencia del gel 2D reveló cambios de color de manchas de proteínas individuales, que fueron causados ​​por cambios en la estabilidad térmica de una proteína al interactuar con SB2301.

Como se muestra en la Fig. 3A y la Fig. 9 complementaria, aproximadamente nueve puntos rojos o verdes aparecieron repetidamente en las imágenes de gel 2D de las muestras tratadas a temperaturas más altas, lo que indica una estabilidad térmica de la proteína mejorada (roja) o disminuida (verde) tras el compromiso de SB2301. Se identificaron catorce candidatos a proteínas mediante espectrometría de masas (Tabla complementaria 2). Se realizó un ensayo de cambio térmico celular (CETSA) en varias proteínas candidatas para validar los experimentos de ID objetivo (Fig. 3B y Fig. 10 complementaria). Para priorizar los candidatos a proteínas objetivo, realizamos una encuesta bibliográfica sobre sus funciones y seleccionamos tres proteínas, PCYT2 (etanolamina-fosfato citidililtransferasa 2), ACSL4 (ácido graso de cadena larga-CoA ligasa 4) e IDH1 (isocitrato deshidrogenasa [ NADP] citoplasmático), que están estrechamente relacionados con el metabolismo de los lípidos celulares. Luego verificamos si cada proteína objetivo podría influir en la cantidad o el tamaño de los LD celulares con un estudio de pérdida de función. Como se muestra en la Fig. 3C y la Fig. 11 complementaria, observamos que el nivel celular de PCYT2 se correlacionó inversamente con los recuentos de LD celulares, lo que sugiere que PCYT2 podría influir en el mecanismo de activación de la lipofagia de SB2301.

A Imágenes superpuestas del canal Cy3 (proteoma verde tratado con DMSO) y Cy5 (proteoma rojo tratado con SB2301). Los puntos indicados (flecha blanca) se volvieron rojos a 59,1 °C y luego desaparecieron a 63,1 °C. B Immunoblot de CETSA que representa la unión específica de SB2301 con PCYT2. Se trataron 20 μM de SB2301 y el compuesto negativo (10) en células HepG2 durante 1 hora. El recuento de C LD cambia tras el agotamiento de Pcyt2, Acsl4 e Idh1 utilizando los ARNsi respectivos. Las células HepG2 se transfectaron con siRNA durante 48 h y luego se obtuvieron las imágenes LD fluorescentes. Todos los datos se representan como diagramas de puntos con la media ± DE, (n = 3). Los datos se analizaron usando una prueba t no pareada. *P = 0,0123 frente a si-scr. D Sensorgramas representativos del análisis de resonancia de plasmón superficial (SPR) de la unión de SB2301 a PCYT2 humano. La constante de disociación de equilibrio (KD) se calculó después de un ajuste 1:1 con modo cinético (superior) o de afinidad (inferior).

Luego realizamos un experimento biofísico para examinar la unión específica de SB2301 a PCYT2 mediante análisis de resonancia de plasmones superficiales (SPR) y confirmamos el compromiso directo de SB2301 con PCYT2 en un modo de unión 1: 1 (Fig. 3D). Dado que el valor estimado de la constante de disociación de equilibrio (Kd) de SB2301 para PCYT2 fue ~26 μM, es posible que PCYT2 no sea el único objetivo proteico de SB2301. Sin embargo, sus análogos sintéticos (3 y 10), que carecen de actividad reductora de LD, no mostraron cambios en la estabilidad térmica con PCYT2 en CETSA (Figura 12 complementaria) ni eventos de unión en el análisis SPR (Figura complementaria 13A, B). Por el contrario, en el caso del análogo sintético 14 (actividad reductora de LD moderada con citotoxicidad) o 13 (actividad reductora de LD mínima), observamos la unión directa con PCYT2 con una tendencia similar a su actividad reductora de LD (Fig. 13C complementaria). , D). Por lo tanto, concluimos que PCYT2 podría ser una posible proteína objetivo correlacionada con la reducción de LD celular mediada por SB2301.

Se sabe que PCTY2 cataliza la síntesis de CDP-etanolamina, un precursor de la síntesis de PE en el citosol38. Colina/etanol-amina fosfotransferasa (CEPT) sintetiza PE utilizando CDP-etanolamina en la membrana del RE, y el paso mediado por PCYT2 es el paso que determina la velocidad de la síntesis de PE celular (Esquema complementario 2)39. Con base en esta información, investigamos los cambios que podrían ocurrir cuando SB2301 se une a PCYT2. Aunque la función enzimática de PCYT2 no se vio afectada por el tratamiento con SB2301 (Fig. 14 complementaria), observamos la translocación de PCYT2 a la superficie de LD incluso después de un tiempo de tratamiento corto (dentro de 1 h) (Fig. 4A, B para SB2301, Fig. complementaria 15 para DMSO). Además, SB2301 indujo la translocación de PCYT2 a la superficie de LD de una manera dependiente del tiempo y la dosis (Fig. 16 complementaria y Video complementario 1–4). En particular, los LD de gran tamaño comenzaron a formarse dentro de un marco de tiempo similar a la translocación de PCYT2 a la superficie de LD (Fig. 4A, C, Figs. Suplementarias 7A, 17 para SB2301 y Fig. 18 Suplementaria para DMSO). Por lo tanto, inferimos que la ampliación de LD podría surgir con la translocación de PCYT2 inducida por SB2301, que permite el suministro directo y rápido de CDP-etanolamina a la superficie de LD y el posterior aumento de PE en la superficie de LD. Los principales componentes fosfolípidos de la membrana LD son PE y PC3. El PC adopta una forma cilíndrica, mientras que el PE adopta una forma cónica debido a su cabeza polar más pequeña40. Debido a las diferentes propiedades biofísicas y formas generales de los dos fosfolípidos, la relación PE/PC en la membrana del LD influye en la curvatura y el tamaño del LD para permanecer en un estado de mínima entropía40. Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que SB2301 induce la translocación de PCYT2 en la superficie de LD, y esta reubicación espaciotemporal de PCYT2 aumenta preferentemente los niveles de PE en la superficie de LD, lo que en consecuencia conduce a la coalescencia de pequeñas LD inestables en grandes LD para minimizar la superficie. tensión al reducir su curvatura (Fig. 4D). Medimos la relación PE/PC en LD celulares para probar esta hipótesis. Aunque no pudimos observar ningún cambio en la cantidad de PE o PC en las células enteras tratadas con SB2301 (Fig. 19 complementaria), se observaron aumentos sustanciales en la relación PE/PC de las LD aisladas (Fig. 4E). Por lo tanto, la cantidad de PE en la superficie de LD aumentó por la translocación de PCYT2 inducida por SB2301, y la relación PE/PC resultante en la superficie de LD perturbó su estabilidad biofísica, lo que posteriormente condujo a la coalescencia de LD.

A Imágenes representativas de inmunofluorescencia de PCYT2 (verde) y LD (azul, BODIPY 493/503). Las células HepG2 se trataron con SB2301 10 μM en los tiempos indicados. Las células se fijaron y se inmunoteñeron para la detección de PCYT2. B Cuantificación de PCYT2 en el LD. El área superpuesta entre LD y PCYT2 en cada condición experimental se analizó utilizando el software ImageJ. Las imágenes fueron seleccionadas al azar de triplicados biológicos. Todos los datos se representan como diagramas de puntos con la media ± DE. Los datos se analizaron usando una prueba t no pareada. *P = 0,0423, **P = 0,0038, ***P = 0,0002. C La distribución de tamaños de los LD purificados se midió mediante dispersión de luz dinámica. Las células HepG2 se trataron con SB2301 10 μM durante 9 h antes de la purificación de las LD celulares. D Ilustración esquemática de la coalescencia de LD mediante la modulación de su relación PE/PC. E La medición de la relación PE/PC en LD purificados muestra que el tratamiento con SB2301 aumenta espacialmente la relación PE/PC. Todos los datos se representan como diagramas de puntos con la media ± DE, (n = 3). Los datos se analizaron utilizando la prueba t pareada. **P = 0,0077. F El grado de contribución y los LD restantes se analizaron a partir de imágenes de fluorescencia de LD en cada momento. El grado de contribución se calculó según la definición. El número de LD restantes se obtuvo dividiendo el área total de LD por los recuentos de células. Tras el tratamiento con SB2301, el modo del gráfico azul (la condición tratada con SB2301) cambió al diámetro LD más grande y luego volvió a su valor original. Se capturaron imágenes de fluorescencia LD de células HepG2 tratadas con 20 μM de SB2301 durante los tiempos indicados. Todos los datos se representan como la media ± DE. G, H Imágenes de fluorescencia LD representativas y resultados de cuantificación en células HepG2 eliminadas con Atg5. Las células agotadas en ATG5 se trataron con 20 μM de SB2301 durante 48 h. El grado de contribución de los LD se analizó como se describe en E. Todos los datos se representan como la media ± SD. I, J Imágenes de fluorescencia LD representativas y resultados de cuantificación de células HepG2 eliminadas por Ubb. Las células empobrecidas en UBB se trataron con 20 μM de SB2301 durante 48 h. Luego se analizó el grado de contribución de los LD como se describe en E. Todos los datos se representan como la media ± SD.

Para dilucidar la correlación entre la lipofagia y el aumento de la relación PE/PC en la membrana del LD, analizamos sistemáticamente los cambios dinámicos en el tamaño del LD. La coalescencia de LD pequeños durante el período anterior del tratamiento con SB2301 explicó la disminución en los recuentos de LD celulares sin activar completamente el proceso de autofagia (Fig. 2A complementaria). La proporción de LD grandes aumentó gradualmente alrededor de las 6 h (Fig. 4A y Fig. 16 complementaria). En el mismo período, también se activó la vía de la autofagia (Fig. 2B). Al analizar el grado de contribución de los LD celulares a lo largo del tiempo, observamos un cambio dinámico en los volúmenes de LD celulares (Fig. 4F). Tras el tratamiento con SB2301, se produjo la coalescencia de LD durante un máximo de 18 h; a partir de entonces, la proporción de LD grandes dejó de aumentar y comenzó a disminuir debido a la continua degradación de LD. Finalmente, la distribución del tamaño de LD volvió a su valor original, pero el volumen total de LD celular se redujo al 64,2% a las 24 h (Fig. 4F). Sin embargo, la distribución del volumen de LD no volvió a su patrón original incluso después del tratamiento con SB2301 bajo condiciones Atg5- (Fig. 4G, H y Fig. 21 complementaria para SB2301; Figs. 20, 21 complementarias para DMSO) o Ubb-knockdown ( Fig. 4J, I y Fig. 21 suplementaria para SB2301, Figs. 20, 21 suplementaria para DMSO). A partir de estas observaciones, inferimos que el tratamiento con SB2301 indujo la translocación de PCYT2 en la superficie de LD y que la relación PE/PC aumentó en la membrana de LD, lo que llevó a la coalescencia de LD. La fusión de LD a través de un aumento en la relación PE/PC ocurrió primero independientemente de la autofagia. Los LD grandes desfavorables resultantes pueden desencadenar lipofagia mediada por ubiquitina.

Realizamos un experimento de persecución de pulsos de ácidos grasos libres de fluorescencia41 para determinar el destino de los ácidos grasos libres producidos por la lipofagia. El FFA marcado con BODIPY (BODIPY-C12) es uno de los mejores reactivos para rastrear el movimiento intracelular de FFA desde LD simplemente monitoreando la señal de fluorescencia de BODIPY-C12. Por ejemplo, las células con altas demandas energéticas pueden activar la lipofagia y extender la β-oxidación mitocondrial de los FFA para producir más ATP para su supervivencia42. Cuando las células se incubaron con BODIPY-C12 y luego se agotaron con suero, se encontraron más FFA en las mitocondrias que en las LD (Fig. 5A, B). De manera similar, observamos que el tratamiento con SB2301 indujo la degradación de los LD celulares a través de la lipofagia y produjo FFA que se acumularon en las mitocondrias para la β-oxidación (Fig. 5A, B). Medimos la tasa de consumo de oxígeno (OCR) de las células en ausencia y presencia de SB2301 y confirmamos que las células aumentaron su capacidad respiratoria adicional (SRC) en respuesta al tratamiento con SB2301 (Fig. 5C, D y Fig. 22 complementaria). Las células ajustan sus estados metabólicos con SRC mitocondrial mejorado bajo demandas de alta energía o condiciones de alto estrés para protegerse de los estímulos ambientales43,44,45. Similar al aumento de SRC, las células responden a los estímulos ambientales a través de la proteína quinasa activada por AMP (AMPK), un sensor de energía representativo, y activan su señalización aguas abajo para regular la β-oxidación46; La activación de AMPK permite la fosforilación e inactivación de la acetil-CoA carboxilasa (ACC), un potente inhibidor de la oxidación de ácidos grasos mitocondriales, lo que lleva a una mayor oxidación de ácidos grasos47,48. Mediante análisis de transferencia Western, confirmamos que AMPK y ACC fueron fosforilados por SB2301 (Fig. 23 complementaria). El aumento en la fosforilación de ACC mediada por SRC y AMPK tras el tratamiento con SB2301 indicó que las células activaron el sistema de amortiguación para consumir o eliminar los FFA producidos por la lipofagia mediada por SB2301, reduciendo así el estrés celular como la lipotoxicidad.

A Imágenes representativas de fluorescencia de células vivas del ensayo de persecución de pulsos FFA con FFA marcado con BODIPY. Se trataron 2 μM de BODIPY-C12 en células HeLa durante 21 h. Luego, las células se trataron con 5 μM de SB2301 o se incubaron en un medio sin suero durante 24 h adicionales. Las mitocondrias se tiñeron con Mitotracker y la LD se tiñó con SF44. Las imágenes se fusionaron designando rojo para las mitocondrias, azul para BODIPY-C12 y verde para LD. B Se calculó el coeficiente de correlación de Pearson para demostrar la colocalización de las señales BODIPY-C12 y Mitotracker. Las imágenes fueron seleccionadas al azar de triplicados biológicos. Todos los datos se representan como diagramas de puntos con la media ± DE. Los datos se analizaron usando una prueba t no pareada. **P = 0,0052 frente a DMSO, ##P = 0,0070 frente a DMSO. C Medición de la tasa de consumo de oxígeno. Las células AML12 se trataron con 20 μM de SB2301 durante 24 h. Todos los datos se representan como la media ± DE. podredumbre + hormiga; rotenona + antimicina A. D Capacidad respiratoria adicional calculada (capacidad respiratoria máxima: respiración basal) de C. Todos los datos se representan como gráficos de puntos con la media ± DE, (n = 4). Los datos se analizaron usando una prueba t no pareada. ***P = 0,0004.

La degradación de LD puede ser un fenotipo único y beneficioso para el descubrimiento de fármacos, ya que la acumulación excesiva de LD está altamente relacionada con las principales causas de diversas enfermedades metabólicas18. Además, la cantidad de AGL regula las enfermedades del hígado graso no alcohólico49. En este contexto, el mecanismo de la lipofagia activada por SB2301 podría ser una posible estrategia terapéutica, ya que SB2301 reduce eficazmente la LD y consume ácidos grasos libres. Para explorar este nuevo mecanismo de activación de la lipofagia como estrategia terapéutica, aplicamos SB2301 a modelos de enfermedades in vitro, particularmente esteatosis hepática. Para desarrollar un modelo de esteatosis in vitro, empleamos dos sistemas modelo mediante el tratamiento de células HepG2 con ácido oleico (OA)50 y tamoxifeno (TM)51 para imitar un sistema dietético alto en grasas simple y un sistema de esteatohepatitis severa, respectivamente. En ambos modelos de esteatosis hepática, SB2301 redujo el recuento de LD celular y el área de forma dependiente de la dosis (Fig. 6). Estos hallazgos confirman que el mecanismo de reducción de LD mediado por lipofagia recientemente investigado podría usarse como una estrategia terapéutica para enfermedades metabólicas, incluida la enfermedad del hígado graso no alcohólico y la esteatohepatitis no alcohólica.

A Imágenes representativas de LD de fluorescencia de células vivas de SB2301 en modelos de esteatosis hepática tratados con OA y TM. B Resultados de la cuantificación del recuento de LD celular y el área de A. Todos los datos se representan como diagramas de puntos con la media ± DE, (n = 3). Los datos se analizaron usando una prueba t no pareada. ****P < 0,0001, ***P = 0,001, $$$P = 0,0002 frente a DMSO, ###P = 0,0004, **P = 0,0093 frente a DMSO.

El LD celular regula la homeostasis energética y el metabolismo de los lípidos cambiando su cantidad y tamaño en respuesta a cambios ambientales, como estados de enfermedad y condiciones energéticas52. La investigación de LD ha ganado un interés considerable en la academia y la industria debido a su relevancia en condiciones fisiopatológicas. Sin embargo, solo unos pocos estudios han explorado los mecanismos reguladores de las LD celulares, especialmente mediante la autofagia selectiva, es decir, la lipofagia. Aquí, descubrimos una pequeña molécula bioactiva, SB2301, que reduce los LD celulares sin citotoxicidad severa a través de un enfoque basado en el fenotipo. Luego demostramos que SB2301 redujo los LD celulares al activar la autofagia selectiva al monitorear el secuestro de LD en autofagosomas y autolisosomas, lo que lleva a la degradación lisosomal. Curiosamente, el tratamiento con SB2301 promovió la ubiquitinación en la superficie de la LD, lo que permitió el reconocimiento de sustratos específicos para la autofagia selectiva31,32,35, aunque aún no se han informado las LD ubiquitinadas y su asociación con la lipofagia. Por lo tanto, descubrimos un mecanismo molecular novedoso de lipofagia mediada por ubiquitina intracelular. Varias preguntas siguen sin respuesta, incluida la identidad de las proteínas ubiquitinadas en la superficie de LD y el mecanismo por el cual los fagóforos reconocen y secuestran las LD53 ubiquitinadas. Sin embargo, SB2301 combinado con proteómica cuantitativa puede servir como una herramienta de investigación única para investigar los nuevos mecanismos de lipofagia mediados por ubiquitina.

PCYT2 se identificó como una proteína objetivo de SB2301 usando TS-FITGE. El tratamiento con SB2301 indujo la translocación de PCYT2 a LD celulares sin afectar su actividad enzimática. Creemos que la translocación de PCYT2 mediada por SB2301 a la superficie de LD podría activar un aumento en la relación PE/PC específicamente en LD, lo que influiría en su estabilidad biofísica. Como resultado, el LD desestabilizado se fusionó para minimizar su curvatura y las células activaron la lipofagia para mantener la homeostasis al eliminar los LD grandes desfavorables. Actualmente, no está claro cómo SB2301 induce la translocación de PCYT2 a la superficie de LD y necesita realizar el estudio de desactivación de PCYT2 para demostrar el requisito de PCYT2 para la actividad de SB2301. Sin embargo, los resultados obtenidos en este estudio sirven como estudio piloto para dilucidar el mecanismo molecular detallado de la translocación de PCYT2 y los procesos de lipofagia mediados por ubiquitina.

Aquí, mostramos que SB2301 altera la composición de la membrana de los LD celulares a través de la regulación espacial de PCYT2, que suministra directamente CDP-etanolamina a la membrana del LD. CEPT media en la unión de CDP-etanolamina con diacilglicerol, el paso final para la síntesis de PE, y CEPT solo existe en la superficie del RE54. Sin embargo, se sabe que la CDP-colina no requiere necesariamente CEPT para sintetizar PC en LD. Además, la translocación de colina-fosfato citidililtransferasa (PCYT1A) a la propia LD puede aumentar la cantidad de PC y prevenir la fusión de LD55. La similitud entre PE y PC en su mecanismo biosintético y síntesis espacial56 podría respaldar el mecanismo propuesto en este estudio. En conjunto, SB2301 indujo la translocación de PCYT2, lo que provocó un aumento espacial en la relación PE/PC en la membrana LD. La inestabilidad biofísica resultante de la membrana de LD provoca la coalescencia de LD y activa la lipofagia mediada por ubiquitina para mantener la homeostasis celular. Serían esenciales más estudios de proteómica para el interactoma de la proteína diana PCTY2 y la identificación de proteínas de superficie LD ubiquitinadas para demostrar cómo la superficie LD coalescente induce la ubiquitinación de proteínas, activa la lipofagia e identifica a los actores clave en este mecanismo activador de lipofagia. Sin embargo, esta lipofagia mediada por ubiquitina podría proporcionar una estrategia novedosa para reducir el contenido de lípidos intracelulares sin inducir lipotoxicidad porque los FFA producidos a partir de LD degradados pueden consumirse en las mitocondrias, como se muestra en este estudio basado en fenotipos. Además, la reducción de la LD celular en modelos de esteatosis hepática in vitro se demostró como una nueva estrategia terapéutica para tratar enfermedades metabólicas causadas por la acumulación de grasa, incluida la esteatohepatitis no alcohólica.

Anti-LC3B (ab51520), anti-PCYT2 (ab126142), anti-IDH1 (ab81653), anti-ubiquitina (ab7780), anti-ATG5 (ab108327), anticuerpos secundarios IgG anti-conejo conjugados con TRITC (ab6718) y anti -DGAT1 (ab178711) se adquirieron de Abcam. Anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (CST 2118), IgG anti-ratón marcado con HRP (CST 7076) y anticuerpos secundarios IgG anti-conejo marcados con HRP (CST 7074) se adquirieron de Cell Signaling Technology. Anti-ACSL4 (sc-271800) y anti-WDR1 (sc-393159) se adquirieron de SantaCruz. Anti-SOAT1 (Novus Biologicals, NB400-141) se adquirió de Novus Biologicals. Anti-SOAT2 (Cayman, 100027) se adquirió de Cayman. Anti-DGAT2 (Thermo, PA5-21722) se adquirió de Thermo Scientific.

El plásmido mCherry-GFP-LC3 (vector pBabe) fue proporcionado por el Dr. Heesun Cheong, División de Biología Química, Instituto de Investigación, Centro Nacional del Cáncer, Corea. El plásmido mCherry-LC3 se adquirió de Addgene (40827).

El sistema de imágenes DeltaVision Elite de GE Healthcare se utilizó para un experimento de imágenes de alta resolución. Las lentes del objetivo se equiparon con un microscopio invertido Olympus IX-71. La cámara sCMOS y el módulo de iluminación de fluorescencia InSightSSI estaban equipados con el sistema. Para obtener imágenes de células vivas, se instaló con el sistema una cámara de soporte de CO2 con un calentador de aire objetivo. Las imágenes se analizaron con el programa SoftWorks respaldado por GE Healthcare.

Las células HepG2 se cultivaron en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero fetal bovino (FBS) al 10 % (v/v) y solución de antibiótico-antimicótico (AA) al 1 % (v/v). Se cultivaron células de cáncer de cuello uterino humano HeLa en medio RPMI 1640 con FBS al 10 % (v/v) y solución de AA al 1 %. Las células AML12 se cultivaron en DMEM/F12 (1:1) (Gibco, 11330-032), 1 × Suplemento de insulina-transferrina-selenio-G (Gibco, 41400-045), dexametasona (40 ng/ml finales), 10 % (v/v) FBS y solución de AA al 1% (v/v). Las células se mantuvieron en una placa de cultivo celular de 100 mm en una incubadora a 37 °C, en atmósfera humidificada con 5% de CO2.

Las células vivas se trataron con SF44 (10 μM) y Hoechst 33342 (2 μg/ml). La condición sin suero (como control positivo) se cambió a medio completo antes del tratamiento con SF44 y Hoechst. Después de 30 minutos de incubación, se realizaron imágenes de fluorescencia automáticas con InCell Analyzer 2000 [GE Healthcare] o DeltaVision Elite [GE Healthcare] sin lavar. Utilizando InCell Analyzer 2000, se capturaron automáticamente imágenes de cuatro puntos seleccionados al azar por pocillos individuales en una placa de 96 pocillos. Las imágenes se tomaron en modo de enfoque automático con un aumento de 20x. Las imágenes de fluorescencia se realizaron utilizando los siguientes ajustes de filtro: excitación_emisión, 430/24 nm_605/64 nm para LD; 350/50 nm_455/50 nm para núcleo en InCell Analyzer 2000 o 438/24 nm_559/38 nm para LD; 380/18 nm_435/48 nm para núcleo en DeltaVision Elite. De acuerdo con el protocolo del fabricante, los datos se analizaron con el programa InCell Developer. La intensidad de fluorescencia de LD se interpretó como un orgánulo celular usando un módulo de granularidad, y el área de las células individuales se reconoció mediante tinción de núcleos usando segmentación de collar.

Las células se sembraron en una placa transparente de 96 pocillos seguido de un tratamiento compuesto durante los tiempos indicados. El ensayo de viabilidad celular se realizó con el ensayo WST siguiendo el protocolo del fabricante.

Las células HepG2 se sembraron en una placa de 12 pocillos seguido de un tratamiento compuesto durante el tiempo indicado. La cantidad de triglicéridos se midió mediante un kit de ensayo de triglicéridos (Abcam, ab65336), siguiendo el protocolo del fabricante.

Las células HepG2 se trataron con SB2301 durante los tiempos indicados. El ADN genómico se extrajo de células HepG2 con el kit de extracción de ADN DNeasy (Qiagen, 69581) según las instrucciones del fabricante. 20 ng de ADN genómico se sometieron a PCR cuantitativa (qPCR). La mezcla maestra KAPA SYBR FAST ABI Prime qPCR (KK4605) y los cebadores directo/inverso (200 nM) contra el ADN mitocondrial humano o la GAPDH humana se mezclaron en un volumen final de 20 μl con agua libre de nucleasas. La PCR se realizó con StepOnePlus (Applied Biosystems), y se utilizó el ciclo de PCR; desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 3 s y extensión a 60 °C durante 25 s. Los datos se analizaron mediante el método CT comparativo y los niveles de ADN mitocondrial se normalizaron a niveles de GAPDH.

El ARNm total se aisló de células HepG2 tratadas con SB2301 utilizando el mini kit RNeasy Plus (Qiagen 74134). La reacción de transcripción inversa (RT) se realizó con AccuPower Cycle Script RT PreMix (Bioneer, K-2044) con 1 μg de ARNm total en un volumen final de 20 μl con agua libre de nucleasas en las siguientes condiciones: 12 ciclos con primer recocido a 30 °C durante 1 min y síntesis de ADN a 50 °C durante 4 min. 1 μl de producto RT se sometió a PCR cuantitativa (qPCR). La mezcla maestra KAPA SYBR FAST ABI Prime qPCR (KK4605) y los cebadores directo/inverso (200 nM) contra cada gen se mezclaron en un volumen final de 20 μl con agua libre de nucleasas. La PCR se realizó con StepOnePlus (Applied Biosystems), y se utilizó el ciclo de PCR; desnaturalización inicial a 95 °C durante 3 min, seguida de 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 3 s y extensión a 60 °C durante 30 s. Los datos se analizaron mediante el método CT comparativo y cada nivel de expresión se normalizó a los niveles de GAPDH.

Las células se lisaron con tampón de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) (Tris 50 mM, pH 7,8, NaCl 150 mM, desoxicolato al 0,5 %, IGEPAL CA-630 al 1 %) y cóctel de inhibidores de proteasa (Roche). Los lisados ​​se obtuvieron tras centrifugar a 15.000 rpm durante 20 min, transfiriendo el sobrenadante. La concentración de proteínas se cuantificó con el kit de ensayo de proteínas BCA. Los procedimientos generales de muestreo de proteínas se realizaron a 4 °C. Las muestras de proteínas preparadas se analizaron con SDS-PAGE seguido de un procedimiento de transferencia Western. Las proteínas se transfirieron a la membrana de PVDF y se bloquearon con BSA al 2 % en TBST durante 1 hora a temperatura ambiente (ta). Los anticuerpos primarios se trataron durante la noche a 4 °C [Anti-LC3B; 1:2000, anti-ATG5; 1:1000, anti-gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH); 1:2000, anti-DGAT1; 1:1000, anti-DGAT2; 1:1000, anti-SOAT1; 1:500, antiSOAT2; 1:500] seguido de lavado con TBST. El anticuerpo secundario IgG anti-conejo marcado con HRP o el anticuerpo secundario IgG anti-ratón marcado con HRP (1:5000) se trataron a temperatura ambiente durante 1 h. Después de lavar con TBST, la membrana se reveló con la solución principal Amersham ECL. La señal quimioluminiscente se midió mediante el sistema de imágenes ChemiDocMP.

Las células HeLa se sembraron en un cubreobjetos con cámara Lab-Tek II con cubierta n.º 1,5 estéril de borosilicato/8 pocillos (Nunc 155409), 24 h antes de la transfección. El plásmido mCherry-GFP-LC3 o el plásmido mCherry-hLC3 se transfectaron a células HeLa utilizando el reactivo Lipofectamine 2000. La transfección se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante.

Las imágenes de fluorescencia de las células HeLa transfectadas con mCherry-GFP-LC3 se obtuvieron con una escala de 60x, utilizando conjuntos de filtros mCherry/mCherry, GFP/GFP (excitación/emisión). mCherry (excitación: 575/25 nm, emisión: 625/45 nm); y GFP (excitación: 475/28 nm, emisión: 525/48 nm). Las imágenes se analizaron con el software de desconvolución SoftWorks.

Las células HeLa transfectadas con mCherry-hLC3 se trataron con SF44 (10 μM) durante 30 minutos antes de la toma de imágenes. Las imágenes de fluorescencia se obtuvieron con un aumento de 100x utilizando conjuntos de filtros mCherry/mCherry (excitation_emission, 575/25 nm_625/45 nm) y CFP/YFP (excitation_emission, 438/24 nm_559/38 nm). Las imágenes se analizaron utilizando el software de desconvolución SoftWorks.

Antes de las imágenes de fluorescencia, los lisosomas se tiñeron con Lysotracker DeepRed (50 nM, Thermo Scientific, L7528) durante 1,5 h. Los LD se tiñeron con SF44 (10 μM) y los núcleos se tiñeron con Hoechst 33342 (2 μg/ml) durante 30 min. Las imágenes se obtuvieron con un aumento de 100x usando Cy5/Cy5, (excitación_emisión, 632/22 nm_676/34 nm), FITC/TRITC (excitación_emisión, 475/28 nm_594/45 nm) y DAPI/DAPI (excitación_emisión, 380/ 18 nm_435/48 nm). Las imágenes se analizaron utilizando el software de desconvolución SoftWorks.

Las células se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fría y se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS. Las células se incubaron en Triton X-100 al 0,1 % en PBS durante 15 min a temperatura ambiente para la permeabilización. Las muestras se lavaron tres veces con PBS helado, seguido de incubación con BSA al 2 % en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. ) en PBS con BSA al 1 % y BODIPY 493/503 3 μM (Thermo, D3922) a 4 °C durante la noche. El anticuerpo primario se decantó y se lavó tres veces con PBS. A continuación, se aplicó a las muestras una solución diluida de anticuerpo IgG-TRITC anti-conejo (1:200) con BODIPY 493/503 3 μM y Hoechst 33342 (2 μg/ml) y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de lavar tres veces con PBS, las imágenes de fluorescencia se capturaron usando microscopía de fluorescencia DeltaVision Elite (100x) usando TRITC/TRITC, (excitación_emisión, 542/27 nm_594/45 nm), FITC/FITC (excitación_emisión, 475/28 nm_525/48 nm ), y DAPI/DAPI (excitation_emission, 380/18 nm_435/48 nm). Las imágenes se analizaron utilizando el software de desconvolución SoftWorks.

Se incubaron células HepG2 de carcinoma hepatocelular humano en DMEM sin suero con SB2301 20 μM (0,2 % (v/v) de DMSO en concentración final) durante 1 hora a 37 °C. Se aplicó choque térmico a las células durante 3 min. Las células resultantes se estabilizaron a 25 °C durante 3 min, se lavaron una vez con PBS y se resuspendieron en PBS que contenía NP-40 al 0,4 % e inhibidor de proteasa. Las células se sometieron a tres ciclos de congelación (nitrógeno líquido)/descongelación para la lisis celular. El lisado celular se aclaró por centrifugación a 20 000 g durante 20 min a 4 °C. Se precipitaron 50 mg de proteína y el sedimento residual se resuspendió en 10 μl de tampón de marcaje (Tris-HCl 30 mM a pH 8,6, tiourea 2 M, urea 7 M y CHAPS al 4 % (p/v)) con sonicación. Los proteomas solubles se mezclaron con Cy3-NHS 0,4 mM (para el grupo tratado con DMSO) o Cy5-NHS (para el grupo tratado con SB2301) y se incubaron a 4 °C durante 45 min. Los proteomas conjugados con colorante se precipitaron con acetona fría y se resuspendieron en 75 μl de tampón de rehidratación (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 2 % (p/v), DTT 40 mM y tampón IPG al 1 %). Las muestras tratadas con SB2301 tratadas con DMSO se mezclaron y se cargaron 150 μl (75 μl para cada uno marcado con Cy3 y Cy5) de proteomas en un gel Immobiline Drystrip de 24 cm [GE Healthcare]. El enfoque isoeléctrico se realizó con Ettan IPGphor 3 [GE Healthcare] seguido de SDS-PAGE bidimensional con un sistema Ettan DALTsix [GE Healthcare]. El gel se escaneó con un Typhoon Trio [GE Healthcare]. Para LCMS/MS, el gel se cortó después de la tinción con plata.

Las manchas de proteína del gel teñido con plata se extirparon, destiñeron y digirieron con tripsina. La mezcla se evaporó en SpeedVac y luego se disolvió en acetonitrilo al 10 % con ácido fórmico al 0,1 %. Los péptidos resultantes se desalinizaron en una columna trampa (180 μm × 20 mm, Symmetry C18) y se separaron en una columna analítica de fase reversa C18 (75 μm × 200 mm, 1,7 μm, BEH130 C18) [Waters] con una ionización por electropulverización Pico Punta (±10 μm id) [Nuevo objetivo]. Los datos fueron convertidos a archivos .pkl por Protein Lynx Global Server y buscados por el motor MASCOT con la base de datos SwissProt.

Las células HepG2 tripsinizadas se incubaron en medio DMEM sin suero con el compuesto 20 μM (concentración final de DMSO al 0,2 % (v/v)) durante 1 hora a 37 °C. Se aplicó un choque térmico a la célula durante 3 min y las células se estabilizaron a 25 °C durante 3 min. Lavar las células con PBS una vez y resuspender las células con PBS que contiene NP-40 al 0,4 % e inhibidor de la proteasa. Células de lisis con ciclo de congelación (nitrógeno líquido)/descongelación, tres veces. Prepare proteínas solubles y detecte la cantidad de proteína con transferencia Western. (Dilución de anticuerpo primario/anti-ACSL4; 1:1000, anti-PCYT2; 1:1000, anti-IDH1; 1:1000, anti-WDR1; 1:200, anti-GAPDH; 1:2000).

Se aplicaron 20 μM de si-RNA a células HepG2 durante 48 h con Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen, 13778-100) siguiendo los protocolos del fabricante.

La constante de disociación de equilibrio (Kd) hacia PCYT2 se determinó mediante SPR utilizando un instrumento Biacore T100 [GE Healthcare]. El grupo carboxilo en la superficie del chip sensor CM5 se reemplazó con éster de succinimida reactivo mediante una combinación de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) en las celdas de flujo 1 y 2 Se inmovilizó PCYT2 humana (Prospec, enz-221) en la celda de flujo 2 (10000 RU) mediante la formación de enlaces amida con el éster de NHS resultante. El éster de NHS restante en las celdas de flujo 1 y 2 se extinguió mediante inyección con una solución de etanolamina-HCl 1 M (pH 8,0). Durante el proceso de inmovilización, se utilizó PBS como tampón de ejecución. Tras la inmovilización, se inyectaron diferentes concentraciones de los compuestos durante 60 s a un caudal de 10 μL·min−1. Con el mismo caudal, se controló la disociación de la superficie del sensor durante 300 s. Para el tampón de ejecución, usamos PBS 1x (pH 7,3) que contenía DMSO al 3 % y P20 al 0,05 %. Los eventos de unión se midieron a 25 °C. El análisis de datos se realizó con el software de evaluación Biacore T100 [GE Healthcare]. Los sensogramas finales se obtuvieron después de eliminar las respuestas de la celda de flujo 1 y el control de solo tampón. La Kd se calculó ajustando los sensogramas a un modelo de enlace 1:1.

La actividad de PCYT2 se analizó como se describió anteriormente con una modificación menor57. Brevemente, prepare la mezcla de reacción (50 l) en tampón Tris-HCl 20 mM (pH 7,8), DTT 5 mM, MgCl2 10 mM, fosfoetanolamina 650 μM y CTP con varias concentraciones. Luego, la mezcla de reacción se incubó con 0,1 μg de PCYT2 purificado a 37 °C durante 3 min. Las reacciones se terminaron hirviendo durante 2 min. La concentración de producto (pirofosfato) se midió mediante un kit de ensayo de pirofosfato (Lonza, LT07-610) y se calculó la velocidad de reacción. Se añadieron DMSO y SB2301 a la concentración indicada en la mezcla de reacción.

Las imágenes se analizaron con el software ImageJ [Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.]. Las imágenes de fondo del canal PCYT2 se obtuvieron del desenfoque gaussiano utilizando Radius 8, y las imágenes originales del canal PCYT2 se restaron de las imágenes de fondo para corregir el fondo no homogéneo. La máscara LD se preparó ajustando la señal LD ​​de acuerdo con un umbral de intensidad (Imagen > ajustar > umbral) utilizando el algoritmo predeterminado. Para la máscara de borde LD, se utilizó Buscar bordes (Proceso > Buscar bordes) para las imágenes LD con umbral. El área superpuesta entre PCYT2 cuyo fondo se corrigió y la máscara LD o la máscara de borde LD se cuantificó mediante la calculadora de imágenes (Proceso > Calculadora de imágenes) mediante la operación AND. Las imágenes resultantes se umbralizaron y el área se cuantificó mediante Analizar partículas (Analizar > Analizar partículas) utilizando un filtro de tamaño de 5 infinito (píxel).

Los LD se aislaron de células HepG2 (~ 108 células) usando kits de aislamiento de LD (Cell Biolabs, MET-5011) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fracción de membrana, citosol y LD se recogieron para comprobar la pureza. Se añadió 1 ml de cloroformo/acetona (1:1, v/v) para separar las proteínas y los lípidos de las LD aisladas. A continuación, la fase orgánica se recogió para un análisis adicional de la composición de fosfolípidos. Repita este proceso dos veces con el sedimento para disolver los lípidos. Después de eliminar la fase orgánica, el sedimento se secó a temperatura ambiente y se resuspendió con tampón de muestreo SDS para preparar muestras de proteínas para verificar la pureza.

Los datos de dispersión de luz dinámica se obtuvieron con LD purificados en cubeta de PMMA (Ratiolab, 2810100) por Malvern Zetasizer Nano-S. El dispersante y la temperatura se seleccionaron como agua y 25 °C, respectivamente.

Para medir la cantidad de PE y PC en la muestra de lípidos, se usaron el kit de ensayo de PE (Biovision, K499) y el kit de ensayo de PC (Biovision, K576). Los lípidos extraídos de lisados ​​de células enteras o LD celulares purificados se prepararon mediante evaporación de solventes usando un evaporador rotatorio. De acuerdo con las instrucciones del fabricante, se emplearon lípidos secos reconstituidos con tampón de ensayo PE y tampón de ensayo PC para medir cada cantidad.

Se capturaron diez imágenes de fluorescencia en un punto con una profundidad z de 0,8 µm. Las imágenes proyectadas se generaron utilizando el software de desconvolución SoftWorks. Quince imágenes seleccionadas al azar de cada condición se analizaron utilizando InCell Developer [GE Healthcare] y se cuantificaron los diámetros de todos los LD presentes en la imagen dada. Suponiendo que el LD es una esfera perfecta, el volumen de cada gota de lípido se calculó utilizando la relación entre el radio y el volumen (V = 4/3 πr3). Los LD se dividieron en nueve grupos según la longitud del radio. La distribución del tamaño de LD se calculó dividiendo la suma de los volúmenes de LD correspondientes a cada grupo por la suma de los volúmenes de LD totales.

Las células HeLa se incubaron con BODIPY 558/568 C12 2 μM (Thermo, D3835) en medio completo durante 21 h. A continuación, las células se lavaron dos veces con medio completo y se incubaron durante 1 h adicional sin BODIPY 558/568 C12. SB2301 se trató durante 24 h. Para el control positivo, se prepararon por separado células privadas de suero (16 h). Las mitocondrias se marcaron con MitoTracker DeepRed 100 nM (Thermo, M22426), y los LD se marcaron con SF44 10 μM durante 30 minutos simultáneamente antes de la formación de imágenes de fluorescencia. Las imágenes de células vivas se realizaron en 2 h.

Las células AML12 se sembraron en una placa Agilent Seahorse XFe24 y posteriormente se trataron con SB2301. Se hidrató un cartucho sensor con Seahorse XF Calibrant (Agilent, 100840-000) a 37 °C durante la noche en una incubadora sin CO2. La OCR se midió en Seahorse XF DMEM (Agilent, 103757-100) que contenía glucosa 17 mM (Agilent, 103577-100), glutamina 2,5 mM (Agilent, 103579-100) y piruvato 0,5 mM (Agilent, 103578-100) en respuesta a oligomicina 1,5 μM, fenilhidrazona de cianuro de fluorocarbonilo 1 μM (FCCP) y rotenona 0,5 μM + antimicina A (Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit, 103015-100) con Seahorse XFe24 [Agilent].

El tipo de prueba estadística utilizada y el número de réplicas biológicas se especifican en la leyenda de cada figura. Las cifras de cada experimento de cada réplica biológica se pueden encontrar en los Datos complementarios 1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los resultados de proteómica de identificación de objetivos (archivos de picos y archivos de búsqueda) se pueden encontrar en https://doi.org/10.6084/m9.figshare.22215583.v1. Los resultados de cada réplica biológica se proporcionan en Datos complementarios 1. Otros datos generados o analizados en este estudio se proporcionan en este artículo o en sus archivos de información complementarios (incluidos los western blots sin recortar en la Fig. 24 complementaria).

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Este trabajo fue apoyado por la Beca de Iniciativa de Investigación Creativa (2014R1A3A2030423) a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Gobierno de Corea (Ministerio de Ciencia y TIC). JP y MK agradecieron la beca del Programa BK21 Plus.

Centro CRI de Proteómica Química, Departamento de Química, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, Corea del Sur

Jinjoo Jung, Parque Jongbeom, Mingi Kim y Parque Seung Bum

Departamento de Biofísica y Biología Química, Universidad Nacional de Seúl, Seúl, 08826, Corea del Sur

Jaeyoung Ha, Hana Cho y Seung Bum Park

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JJ diseñó y realizó los experimentos biológicos, analizó los datos y preparó el manuscrito. JP, JH y HC realizaron los experimentos biológicos y analizaron los datos. MK diseñó el método sintético y realizó la síntesis. SBP dirigió todo el estudio y participó en todos los aspectos del diseño experimental, análisis de datos y preparación del manuscrito. Todos los autores revisaron críticamente el texto y las figuras.

Correspondencia a Seung Bum Park.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. El manuscrito se consideró adecuado para su publicación sin revisión adicional en Communications Biology. Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor de manejo principal: Manuel Breuer.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Jung, J., Parque, J., Kim, M. et al. La perturbación de la composición de la membrana en las gotas de lípidos mediada por SB2301 induce la lipofagia y la ubiquitinación de las gotas de lípidos. Comun Biol 6, 300 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04682-9

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Recibido: 04 enero 2023

Aceptado: 09 de marzo de 2023

Publicado: 21 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04682-9

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