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Un análisis cuantitativo de varios patrones aplicados en microscopía de lámina de luz de celosía
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Un análisis cuantitativo de varios patrones aplicados en microscopía de lámina de luz de celosía

Jan 14, 2024

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4607 (2022) Citar este artículo

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Detalles de métricas

Los microscopios de lámina de luz reducen la fototoxicidad y el fondo y mejoran la velocidad de obtención de imágenes en comparación con los microscopios confocales y de campo amplio. Sin embargo, cuando está equipado con rayos gaussianos, el poder de resolución axial de un microscopio de lámina de luz y el campo de visión observable están inversamente relacionados. Las láminas de luz basadas en redes ópticas difuminadas mejoran la resolución axial y la uniformidad del haz en comparación con los haces gaussianos mediante el uso de patrones de iluminación estructurados axialmente. Sin embargo, estas ventajas se obtienen a expensas de una mayor iluminación total de la muestra y un menor confinamiento axial del patrón de iluminación. Utilizando simulaciones y medidas experimentales en células vivas y fijas, cuantificamos las diferencias entre las láminas de luz gaussianas y de celosía en la uniformidad del haz, la resolución axial, la resolución lateral y el fotoblanqueo. Demostramos cómo se pueden ajustar diferentes patrones de iluminación de celosía óptica para priorizar la resolución axial o la sección óptica. Finalmente, presentamos un enfoque para fusionar espectralmente adquisiciones secuenciales de diferentes patrones de láminas de luz de celosía con propiedades ópticas complementarias para lograr imágenes de alta resolución y bajo fondo.

Durante las últimas dos décadas, la microscopía de hoja de luz se ha utilizado para obtener imágenes de muestras biológicas de varias escalas, que van desde moléculas individuales hasta organismos completos1,2,3,4. La microscopía de hoja de luz solo ilumina un plano delgado en la muestra. Esto minimiza la iluminación fuera de foco, reduce el fotoblanqueo y aumenta la relación señal-ruido (SNR) en comparación con la epifluorescencia y la microscopía confocal. Además, en la microscopía de fluorescencia, la función general de dispersión de puntos (PSF) es un producto de las PSF de excitación y detección. Por lo tanto, si el patrón de iluminación es comparable o más delgado que la profundidad de campo de detección, la iluminación de un solo plano también puede mejorar la resolución axial. Aunque los métodos de escaneo de puntos como el confocal también aumentan la resolución axial y el corte óptico, la iluminación plana con detección de campo amplio permite una velocidad de imagen de 100 a 1000 veces más rápida con un fotoblanqueo mucho más bajo5.

Las implementaciones más comunes de microscopía de hoja de luz usan lentes cilíndricas para enfocar un haz gaussiano en una hoja extendida lateralmente con un perfil de intensidad axial gaussiana en la muestra. Este enfoque da como resultado una compensación inherente entre el grosor de la lámina ligera y su longitud de propagación. Las láminas de luz gaussianas más delgadas proporcionan una mayor resolución axial y un corte óptico, pero a costa de una longitud de propagación más corta y un campo de visión más pequeño. Por el contrario, las láminas de luz gaussianas más gruesas pueden generar imágenes de áreas más grandes, pero tienen una resolución y una sección óptica más bajas. Para superar estas compensaciones, varios grupos han propuesto el uso de láminas de luz estructuradas para la iluminación, incluidos haces de Bessel6,7, haces de aire8,9 y celosías ópticas2,10 para desacoplar la resolución axial de la longitud de propagación del haz. En la práctica, tales haces idealizados, sin difracción, requerirían una energía infinita y no se pueden realizar físicamente. En cambio, lo que se genera son haces que son un híbrido de haces gaussianos y no difractantes (por ejemplo, Bessel-Gauss o Lattice-Gauss) en los que el patrón de iluminación está limitado por una envolvente de atenuación distribuida axialmente para confinar la energía de iluminación alrededor de un solo plano en el especimen. Variar el ancho de la envolvente de atenuación en la muestra o, de manera equivalente, distribuir la distribución de intensidad de la iluminación en el plano focal posterior del objetivo de excitación a lo largo de kz (que también es la dirección axial del objetivo de detección) permite al usuario sintonizar el carácter del patrón de iluminación para favorecer la longitud de propagación, la resolución axial o el corte óptico según la muestra biológica y los objetivos de imagen.

Dos artículos recientes11,12 han investigado las propiedades de los haces no difractantes en comparación con los haces gaussianos mediante simulaciones11 y medidas experimentales12 (no biológicas). Sorprendentemente, estos documentos sugirieron que las redes ópticas cuadradas (una de las implementaciones de láminas de luz de celosía más utilizadas) tenían cinturas de haz, PSF y funciones de transferencia óptica (OTF) similares a las de los haces gaussianos y que los instrumentos que utilizan haces gaussianos enfocados y redes ópticas cuadradas funcionan indistinguiblemente unos de otros12. Como estos hallazgos parecían contradecir publicaciones previas2 y nuestras propias experiencias previas, buscamos investigar la fuente de estas afirmaciones y caracterizar más completamente las ventajas y las compensaciones entre los haces gaussianos y las láminas de luz de celosía. Con este fin, utilizamos simulaciones ópticas y mediciones experimentales en perlas limitadas por difracción y una variedad de estructuras celulares. Demostramos que al variar la envolvente de límite en la muestra (NA extendida en la pupila de entrada), las hojas de luz estructuradas se pueden ajustar para que se comporten más como una red o como Gauss. Comparamos hojas de luz con la misma longitud de propagación y medimos la PSF, la OTF y realizamos la correlación del plano de Fourier (FPC)13 para evaluar las correlaciones de frecuencia espacial dentro de las imágenes en múltiples ubicaciones a lo largo de la longitud de propagación del haz. Demostramos que, en comparación con los haces gaussianos, las láminas de luz de celosía cuadrada y hexagonal tienen (1) una resolución axial más alta en el foco del haz y (2) mantienen esta resolución más alta en una porción más grande de la propagación del haz. En ambos casos, estas ventajas vienen con la compensación de una mayor energía en los lóbulos laterales que flanquean el haz principal, lo que resulta en una mayor dosis de energía total para la muestra y una disminución del corte óptico. A la luz de esto, caracterizamos las compensaciones en resolución, fotoblanqueo y fototoxicidad para láminas de luz gaussianas, de celosía cuadrada y de celosía hexagonal al obtener imágenes de especímenes fijos y vivos a niveles de proteína endógena y hacemos sugerencias sobre cómo ajustar de manera óptima los parámetros de la lámina de luz para una muestra biológica determinada. Finalmente, presentamos la fusión de imágenes ponderadas espectralmente como un enfoque para combinar imágenes adquiridas usando láminas de luz con propiedades ópticas complementarias.

Comenzamos nuestra caracterización investigando láminas de luz de 20 μm de largo que están optimizadas para obtener imágenes de células adherentes. Mostramos la notación para el sistema de coordenadas utilizado en el resto del artículo en la Fig. 1a. Definimos la longitud del haz por la mitad del máximo de ancho completo (FWHM) del perfil de intensidad a lo largo de la dirección de propagación y (Fig. 1b, c). Observamos que otras métricas para describir la longitud de propagación, como las que se basan en el seccionamiento óptico11, también brindan resultados similares (Tabla S1 y Fig. S1a). Para cuantificar la sección óptica de diferentes hojas de luz, también trazamos el perfil axial de excitación y la intensidad acumulada a lo largo de la dirección axial tanto en el centro del haz como en la longitud de propagación FWHM (Fig. 1d, e). Para empezar, comparamos un haz gaussiano de 0,21 NA, una red MB-cuadrada con NA = 0,35/0,25 (NA máxima y mínima respectivamente) y una red hexagonal con NA = 0,46/0,36. Para haces gaussianos, existe una relación única entre sigma, grosor del haz y longitud de propagación14. Para haces de celosía MB-cuadrados y hexagonales, se pueden generar haces de la misma longitud de propagación, pero con una estructura diferente, ajustando la diferencia entre el NA mínimo y máximo (∆NA), la envolvente de atenuación impuesta en el plano de muestra (∆kz en la pupila), y el espaciamiento de la matriz de Bessel MB-cuadrada (∆kx en la pupila). El efecto de estos parámetros para cada tipo de haz se describirá en la siguiente sección. Aquí mantuvimos un ∆NA constante de 0,1 para vigas de celosía MB cuadradas y hexagonales y elegimos un espaciado de celosía MB cuadrada tal que las vigas laterales estuvieran justo fuera del anillo delimitador interior, como se había hecho anteriormente2. Tanto las redes MB cuadradas como las hexagonales mejoraron la resolución axial en comparación con un haz gaussiano de la misma longitud de propagación (Fig. 1f, h) medido al comparar el FWHM axial PSF general (1.18λ para la red hexagonal, 1.62λ para MB-cuadrado red y 1.83λ para Gaussian, Tabla S2). Estas diferencias se volvieron aún más prominentes cuando se compararon las PSF generales lejos del foco del haz, por ejemplo, en el perfil de propagación FWHM, que en esta situación está a 10 micras del foco del haz (Fig. 1g, i). El FWHM axial de los PSF generales en esta ubicación fue de 1,27 λ para la red hexagonal, 1,6 λ para la red MB-cuadrada y 2,43 λ para el haz gaussiano. Las gráficas del espesor del lóbulo principal como se define en Métodos confirmaron estos resultados, mostrando que los valores del espesor del lóbulo principal para láminas de luz de celosía hexagonal y cuadrada MB permanecen casi constantes a lo largo de la longitud de propagación del haz hasta 22λ mientras que el espesor del lóbulo principal gaussiano aumenta dos -doble sobre este rango (Fig. S1a). También replicamos estos resultados experimentalmente para cada uno de los haces aquí y demostramos un muy buen acuerdo con las simulaciones ópticas (Fig. S2). Juntos, estos resultados demuestran una diferencia claramente distinguible entre las láminas de luz de celosía gaussiana, MB-cuadrada y hexagonal. Las láminas de luz de celosía hexagonal y cuadrada MB tienen una resolución axial más alta y mantienen esta resolución en una porción más grande de la longitud de propagación que los haces gaussianos. Como último ejemplo, investigamos haces planos de la misma longitud que se generan al recortar una franja de iluminación uniforme en el plano de la pupila con una máscara. Estos haces dan como resultado un campo eléctrico que se asemeja a una función Sinc en la muestra con lóbulos laterales de intensidad que se encuentran entre los de un haz gaussiano y una red MB-cuadrada. Los haces de superficie plana mostraron propiedades intermedias, mostrando una resolución axial similar a la gaussiana en el foco del haz, pero menos degradación a lo largo de la dirección de propagación del haz. Como contrapartida, las vigas planas tenían una resolución axial más baja, pero una mejor sección óptica que las láminas de luz de celosía hexagonal o cuadrada MB en todas las ubicaciones (Fig. S3e y Tabla S2).

a Dibujo esquemático de los objetivos de detección y excitación que muestra los marcos de referencia de coordenadas del plano de la muestra y la pupila. b Perfiles de propagación yz simulados de los tres haces diferentes, 0 indica el foco del haz y la línea discontinua blanca indica la FWHM de propagación, la posición donde la intensidad cae al 50 % del pico en el foco. c Corte de línea en z = 0 a lo largo de la dirección de propagación en (b). d Perfil de línea a lo largo de z para el patrón de excitación que se muestra en b en el foco del haz (y = 0, fila superior) y en la mitad del máximo de ancho completo (FWHM) a lo largo de la propagación del haz (y = 24λ, fila inferior). La detección de campo amplio PSF se muestra en una línea discontinua negra. e Perfil de energía de excitación del eje z acumulativo para los tres haces diferentes. El gráfico se calcula en el foco del haz (y = 0, fila superior) y en el FWHM a lo largo de la propagación del haz (y = 24λ, fila inferior). f, g PSF total para los tres haces diferentes en el centro de propagación (y = 0) y en el FWHM a lo largo de la propagación del haz (y = 24λ). h, i Perfil de línea axial para la PSF general que se muestra en (f, g) a lo largo de la línea x = 0. h es cuando el haz está enfocado a lo largo de la dirección de propagación, e i es cuando el haz está en el FWHM a lo largo de la propagación dirección.

Sin embargo, las mejoras en la resolución axial para el enrejado cuadrado MB, el enrejado hexagonal y las láminas de luz de parte superior plana tienen el costo de un menor confinamiento en el perfil z del haz de excitación (Figs. 1e y S3b). El trazado de la intensidad integrada normalizada a lo largo de la dirección axial desde z = 0 ilustra que la energía del haz gaussiano está más confinada en comparación con los otros tipos de láminas de luz probadas. Esto se puede cuantificar mediante la capacidad de seccionamiento óptico, que se define anteriormente como la mitad del ancho dentro del cual se encuentra el 63% de la intensidad acumulada11. La sección óptica para el haz gaussiano es de 0,84 λ en comparación con 1,87 λ y 3,42 λ para las redes MB cuadradas y hexagonales estudiadas aquí. Aunque en el corte del 63%, la sección óptica del haz gaussiano y de parte superior plana es similar (Fig. S1a), los gráficos de las intensidades acumulativas del perfil z de los haces gaussianos y de parte superior plana demuestran un confinamiento reducido para el haz de parte superior plana tanto en el foco del haz y en la longitud de propagación FWHM (Fig. S3b), lo que ilustra los desafíos de elegir un corte único para definir valores para el espesor de la lámina ligera y la sección óptica. En cuanto a nuestras comparaciones de resolución, nuestros PSF de excitación medidos experimentalmente con los mismos tres haces confirman este compromiso entre resolución axial, invariancia de propagación y confinamiento axial consistente con nuestras simulaciones (Fig. S2).

Finalmente, las comparaciones en el espacio real están limitadas en su capacidad para describir completamente la resolución. Por ejemplo, aunque son intuitivas, las mediciones FWHM en el espacio real están dominadas por contenido de baja frecuencia espacial que el sistema transmite de manera eficiente. Estas comparaciones no capturan claramente los cambios en el ancho de banda de frecuencia espacial observable del sistema ni capturan el mayor contenido de información que se puede observar de la muestra y volver a ponderar a través de la deconvolución. Estas características se pueden demostrar más claramente en el espacio de frecuencias comparando el OTF del sistema. La comparación de los OTF para vigas gaussianas, redes MB cuadradas y hexagonales reveló un claro aumento en el soporte de OTF axial para redes MB cuadradas y hexagonales sobre vigas gaussianas tanto en el foco del haz como en la FWHM de propagación (Fig. 2a-f). Para estas comparaciones, el eje OTF se representa como una fracción de 4π/λ, que es el doble del vector de onda. Para una longitud de onda dada, el contenido máximo de frecuencia espacial que se puede obtener a través de imágenes de fluorescencia está definido por una esfera con un radio de 4π/λ. Trazar la relación de la magnitud OTF para las redes MB cuadradas y hexagonales frente al haz gaussiano de longitud equivalente (Fig. 2b) revela que en un rango de frecuencia axial del 30% al 40% de 4π/λ, las láminas de luz de la red tienen 10- un soporte 100 veces mayor que una viga gaussiana de longitud equivalente. Estas diferencias son aún más prominentes lejos del foco del haz (p. ej., en el FWHM del perfil de intensidad a lo largo de la dirección de propagación y) (Fig. 2d).

Imágenes simuladas a escala logarítmica de la amplitud OTF para los tres haces diferentes en el foco del haz (y = 0). b Imágenes a escala logarítmica de la relación de amplitud entre la OTF para las láminas de luz de celosía hexagonal y cuadrada MB divididas por la OTF del haz gaussiano en el foco del haz (y = 0). c, d Gráficos comparativos de (a, b) en el FWHM de la dirección de propagación (y = 24λ). e, f Perfiles axiales de la amplitud OTF a lo largo de la línea kx = 0 (líneas rojas en ayc) en el foco del haz (y = 0) y en la propagación FWHM (y = 24λ).

Dadas las claras ventajas que observamos en términos de resolución y uniformidad en las redes MB cuadradas y hexagonales en comparación con los haces gaussianos que observamos tanto en nuestras simulaciones como en los conjuntos de datos experimentales, buscamos comprender por qué las publicaciones anteriores12 no pudieron detectar estas diferencias. Nuestra hipótesis es que esto podría atribuirse a la elección específica de los parámetros utilizados para definir y cuantificar las vigas de celosía en estudios anteriores o a la configuración experimental específica utilizada para las mediciones. Como se señaló anteriormente, los haces de celosía cuadrada MB y de celosía hexagonal tienen parámetros adicionales que se pueden ajustar de manera que es posible generar láminas de luz con diferentes propiedades que tienen la misma longitud de propagación. Por ejemplo, se puede aumentar (o disminuir) el ∆NA de estos haces. Esto es equivalente a aplicar una envolvente límite de atenuación más estrecha (o más amplia) en la muestra. Como resultado, las redes con ∆NA más grande se vuelven más gaussianas, mientras que aquellas con ∆NA más pequeño se vuelven más como una red. Para un ∆NA dado, se pueden lograr vigas de una determinada longitud variando el NA central sobre el cual se calcula este ∆NA. Las NA centrales más bajas conducen a haces más largos y las NA centrales más altas conducen a haces más cortos.

Demostramos este efecto en las Figs. S4 y S5 para redes MB cuadradas y hexagonales de 20 micras de largo, respectivamente. Al variar ∆NA y el NA central juntos, estos haces de 20 micras pasan de haces más gaussianos con menor resolución axial y mejor confinamiento axial a haces más parecidos a una red con mayor resolución axial y uniformidad pero menor confinamiento. En el espacio de frecuencias, el OTF general es la convolución del OTF de detección de campo amplio junto con el OTF de excitación. El aumento de la NA central del patrón de excitación da como resultado copias del OTF de detección de campo amplio que se desplazan a lo largo del eje kz, lo que permite la observación de información de frecuencia espacial más alta de la muestra. El aumento de ∆NA elimina estas copias desplazadas a lo largo del eje kz para llenar más completamente el espacio de frecuencia y aumentar el seccionamiento óptico. Observamos que para redes MB-cuadradas con NA central alta y ∆NA pequeña, es posible desplazar las órdenes OTF extendidas hasta el punto de que la OTF quede dominada por el lóbulo central centrado en kz = 0, lo que hace que el haz en realidad espacio para parecer más gaussiano (Fig. S4). Para las redes hexagonales, las caídas en el soporte OTF general debido a un ∆NA pequeño darán lugar a lóbulos laterales más grandes en el perfil de excitación y menos confinamiento axial (Fig. S5).

Para las redes cuadradas MB, un parámetro de ajuste adicional es el espaciado de la matriz multi-Bessel, que determina la posición de los dos haces laterales en la pupila posterior. Si bien este es técnicamente un parámetro libre, encontramos que el haz más uniforme se logra eligiendo un espaciado de haz tal que los dos haces laterales inscriban el anillo interior. En esta configuración particular, los cuatro haces de la red MB-cuadrada compartirán el mismo Δky, lo que conducirá a la misma longitud de propagación en la muestra y, por lo tanto, a un perfil de excitación altamente consistente a lo largo de la dirección de propagación. De hecho, variar el espaciado de la matriz multi-Bessel también puede conducir a un cambio en el soporte de OTF de una hoja de luz más parecida a Gaussiana a una hoja de luz más parecida a una red. Como se demuestra en la Fig. S6, desplazar los dos haces laterales hacia adentro de modo que queden recortados por el anillo interno de la máscara conduce a una hoja de luz más hexagonal con FWHM axial reducido en el PSF general y modulación aumentada en el perfil de excitación ( Fig. S6e, f, i–l), mientras que el desplazamiento de los dos haces laterales hacia afuera conduce a una hoja de luz más parecida a Gauss (Fig. S6g, h, i–l).

Estas variables podrían explicar por qué las publicaciones anteriores no pudieron detectar una diferencia en el rendimiento entre los haces gaussianos y las láminas de luz de celosía12. Nuestra hipótesis es que esto podría deberse a las métricas de cuantificación específicas aplicadas o a las combinaciones específicas de NA central, ∆NA, espaciado de red elegido para la comparación. Alternativamente, esta discrepancia podría explicarse por los matices de la configuración experimental utilizada para el estudio en cuestión, en el que la envolvente delimitadora podría aplicarse recortando el patrón en el SLM o limitando la iluminación aguas arriba a través de lentes cilíndricas que pueden haber llevado a la red. patrones que eran de carácter muy gaussiano.

Dadas las ventajas y desventajas observadas aquí, optamos por investigar más a fondo los patrones con un ∆NA de 0,1 para vigas de celosía MB-cuadradas y hexagonales. Estos patrones brindan una opción intermedia entre aumentar la resolución axial y la uniformidad del haz sin sacrificar demasiado el confinamiento del haz. Sin embargo, observamos que la elección del mejor patrón dependerá de la muestra. Por ejemplo, las estructuras fluorescentes escasamente distribuidas, como los hoyos recubiertos de clatrina, los condensados ​​separados en fase o los microtúbulos, pueden aprovechar la mayor resolución axial que ofrecen las redes ópticas menos confinadas sin sufrir excesivamente la fluorescencia fuera de foco. Por el contrario, las muestras densamente fluorescentes como la actina, la GFP citoplásmica o la cromatina densa en el núcleo pueden beneficiarse de patrones de iluminación más confinados al tiempo que sacrifican la resolución axial máxima alcanzable. La capacidad de sintonizar entre patrones que abarcan estas características es una de las ventajas de la microscopía de lámina de luz de celosía.

Dadas las ventajas y desventajas de la resolución axial, la uniformidad del haz y la sección óptica que son inherentes a cada uno de estos haces, buscamos comprender mejor su desempeño utilizando imágenes simuladas. Generamos imágenes que consisten en emisores de múltiples puntos a una densidad inicial de 3 emisores/μm3 y modelamos los efectos del ruido de disparo, la intensidad del emisor y la autofluorescencia de la muestra (ver Métodos). Se muestran cortes de estas imágenes en el plano YZ tanto en el foco del haz como en el FWHM del eje de propagación (Fig. 3a, b). Para cuantificar la resolución, utilizamos FPC, que mide la resolución a través de las correlaciones entre frecuencias espaciales obtenidas de múltiples observaciones independientes. Esto es similar a la correlación de anillos de Fourier (FRC), excepto que es capaz de abordar la anisotropía en resolución en imágenes 3D. En la práctica, calculamos los planos FPC en ky = 0 en función de las imágenes simuladas en 3D sin procesar (Fig. 3c, d). En estas mediciones, la resolución más alta se mide como un área más grande dentro de la región donde el FPC permanece por encima de un valor de corte de 1/713,15. Como se ilustra en la Fig. 3a, las imágenes simuladas muestran una tendencia similar a la de nuestras simulaciones de un solo cordón: de gaussiana a red cuadrada MB a red hexagonal, hay una mejora progresiva en la resolución axial y la resolución general, medida por el extensión axial y área integrada total del FPC por encima del valor de corte (Fig. 3c, e). Además, para haces de celosía MB-cuadrados y hexagonales, la resolución muestra poca degradación a lo largo de la dirección de propagación, mientras que para haces gaussianos la degradación es más sustancial (Fig. 3d, e). Como era de esperar, el fondo de la iluminación fuera de foco también aumenta progresivamente de gaussiano a haz de celosía cuadrada MB a haces de celosía hexagonal. La contrapartida de este mayor fondo es una disminución menor en la resolución lateral a medida que avanzamos a través de los diferentes tipos de haces. Observamos tendencias similares al simular imágenes con una mayor densidad de emisor (10/μm3) (Fig. S7) o un fondo más alto (una relación señal-fondo de 3) (Fig. 3f).

a, b Imágenes representativas de corte xz sin procesar en el FWHM de enfoque y propagación de cada tipo de haz. c, d Imágenes de correlación del plano de Fourier (FPC) calculadas en base a dos copias de imágenes simuladas de forma independiente en (a, b). Para las imágenes FPC de celosías MB cuadradas y hexagonales, mostramos la relación de la amplitud FPC relativa a la gaussiana dentro del rango de corte de 1/7. e, f Área FPC integrada relativa de las imágenes simuladas en diferentes ubicaciones a lo largo de la dirección de propagación. f Igual que (e) excepto que se calcula con una relación señal a fondo más baja (SBR = 3). Las áreas FPC relativas se calculan como el área total en las imágenes FPC kx–kz con un valor superior a 1/7 y luego se normalizan por el área FPC de Gauss en el centro de la propagación. g, h Imágenes desconvolucionadas de Richard-Lucy en (a, b).

De manera similar a la microscopía de campo amplio, este fondo se puede eliminar computacionalmente mediante deconvolución lineal (p. ej., Wiener) o iterativa (p. ej., Richardson Lucy). La deconvolución también suaviza el OTF decreciente no monótonamente en la iluminación de celosía hexagonal, suprimiendo efectivamente las contribuciones de los lóbulos laterales del patrón de excitación (Fig. 3g, h para la deconvolución RL y la Fig. S8 para la deconvolución de Weiner). Estos resultados juntos indican que, a pesar de la disminución del corte óptico, las imágenes generadas con patrones de iluminación de celosía hexagonal y cuadrada MB pueden capturar más información de la muestra, lo que da como resultado imágenes más isotrópicas y de mayor resolución. Debido a la mayor uniformidad del haz, esta mayor resolución se vuelve aún más evidente cuando se compara en el FWHM de la dirección de propagación del haz y cuando la fluorescencia desenfocada se elimina computacionalmente y las frecuencias espaciales OTF se vuelven a ponderar mediante deconvolución. Sin embargo, notamos que, mientras que las láminas de luz de celosía hexagonal y cuadrada MB siempre tenían una resolución axial más alta que un haz gaussiano de longitud similar, el aumento de la resolución general de las láminas de luz de celosía hexagonal y cuadrada MB dependía de la relación señal-ruido dentro del simulado. imagen. Al modelar emisores con una intensidad más baja de 100 conteos (y, por lo tanto, más ruido de disparo) manteniendo la misma relación señal-fondo (Fig. S9), las imágenes de láminas de luz de celosía hexagonal y cuadrada MB tenían una resolución axial más alta; sin embargo, ya no hubo un aumento en la señal FPC integrada en comparación con los haces gaussianos (Fig. S9g). Esto implica que con una relación señal/ruido decreciente, el sacrificio en la resolución lateral debido a la menor sección óptica de las redes cuadradas o hexagonales de MB puede eventualmente superar la ganancia en la resolución axial cuando se calcula el área FPC.

Para verificar si las conclusiones extraídas de nuestras simulaciones persisten en muestras biológicas, a continuación tomamos imágenes de diferentes estructuras subcelulares con los mismos haces mencionados anteriormente. Elegimos obtener imágenes de la cromatina en el núcleo, las mitocondrias y el citoesqueleto de actina, características que abarcan una amplia gama de morfologías y densidades dentro de la célula. Para garantizar una comparación justa, ajustamos las intensidades de modo que cada haz tuviera una intensidad máxima igual en la muestra midiendo la señal de las perlas fluorescentes como se describe en Métodos. En la Fig. 4, mostramos cortes de imágenes YZ crudas y desconvolucionadas RL junto con una región de acercamiento y un perfil de corte de línea de filamentos de actina (Fig. 4a-e), cromatina (Fig. 4f-j) y mitocondrias (Fig. .4k–o) centrado en el foco del haz. En las imágenes experimentales sin procesar, las ventajas y desventajas entre la resolución axial y el confinamiento de la hoja de luz siguen siendo válidas: las imágenes tomadas con vigas de celosía hexagonales y cuadradas MB tienen una mejor resolución axial a costa de un fondo más alto (estas nuevamente pueden cuantificarse mediante FPC como se ilustra en la Fig. S10a-c). Además de este fondo, las imágenes en bruto también revelan la estructura multilobulada de la iluminación de la hoja de luz de celosía hexagonal. Después de la desconvolución, tanto el fondo como los lóbulos laterales se reducen considerablemente (Fig. 4c, h, m). En conjunto, estos conjuntos de datos son consistentes con la conclusión extraída de las imágenes simuladas e indican que las compensaciones entre diferentes haces persisten en varias muestras biológicas fijas.

una visión general en 3D de las estructuras de filamentos de actina en la célula. El contorno naranja muestra el segmento de ROI utilizado para (b, c). b, c Cortes YZ desconvolucionados RL y sin procesar tomados con los tres haces diferentes y una condición MB-cuadrada + hexagonal fusionada. El cuadro delimitador cian se amplía y se muestra a la derecha. d, e Perfiles de intensidad de imagen para cada condición a lo largo de la línea discontinua roja en b, los gráficos de intensidad relativa se presentan en unidades arbitrarias (au). f–o Gráficos comparables a (a–e) para imágenes de cromatina y mitocondrias.

Notamos que, a pesar de una resolución axial más alta en las muestras biológicas, el área FPC integrada en las imágenes de celosía hexagonal y cuadrada MB era más pequeña en comparación con Gaussian (Fig. S10d) debido a la disminución en la resolución lateral del fondo alto (similar a la observación en simulación de múltiples perlas con baja señal en la Fig. S9). Estas observaciones muestran poca dependencia de la intensidad de las imágenes adquiridas (cf. Fig. S11 para imágenes tomadas con una potencia de excitación cuatro veces menor y, por lo tanto, una SNR más baja), lo que indica que para estas dos condiciones de imagen, el aumento del ruido de disparo de la señal fuera de foco fue comprometer la resolución lateral.

Para abordar la pérdida de resolución lateral debido a la menor sección óptica en los modos de iluminación de celosía, aquí proponemos combinar las imágenes de dos iluminaciones secuenciales de la muestra con diferentes láminas de luz con propiedades complementarias. De manera similar a otros enfoques de fusión de múltiples vistas que ven la muestra desde múltiples ángulos16,17, la fusión de láminas de múltiples luces con láminas de luces diseñadas adecuadamente puede llenar de manera efectiva las depresiones en el espacio OTF. Estas fusiones luego combinarían la mayor resolución axial y la uniformidad de propagación de las láminas de luz de celosía hexagonal y cuadrada MB mientras evitan la disminución en la resolución debido al mayor ruido de disparo de una sección óptica más baja. En nuestro enfoque, la fusión multivista se realiza sin desconvolución y se lleva a cabo en el espacio de frecuencias calculando las sumas ponderadas en función de la fuerza OTF de la red hexagonal y cuadrada MB (detalles descritos en Métodos). Este enfoque incorpora efectivamente la señal espectral al ruido de cada imagen y conduce a un OTF más uniforme que la suma de imágenes directa o la suma incoherente de múltiples hojas de luz dentro de una sola exposición de cámara. Como se ilustra en la Fig. S12, la fusión ponderada espectralmente de imágenes de celosía hexagonal y cuadrada MB llenó las caídas en OTF en la celosía hexagonal mientras mantenía su extensión OTF, lo que llevó a un PSF con FWHM axial comparable pero lóbulos laterales disminuidos en comparación con la celosía hexagonal hoja de luz utilizada aquí. Al aplicar la fusión de vista múltiple a imágenes de muestras biológicas fijas, observamos una resolución axial comparable a la red hexagonal pero menos fondo (Fig. 4), lo que lleva a un aumento general en FPC (Fig. S10a-d).

Sin embargo, mientras tomamos imágenes de estructuras celulares más complicadas, observamos que, en ciertos casos, las imágenes adquiridas con iluminación de celosía hexagonal mostraban estructuras espaciales inesperadas que eran inconsistentes con un simple aumento en la resolución axial. En la Fig. S13 se muestra un ejemplo, donde la superficie inferior del núcleo aparece desplazada en comparación con las imágenes desconvolucionadas tomadas con la red MB-square y haces gaussianos. Debido a que hemos demostrado en conjuntos de datos tanto simulados como experimentales que tanto Wiener como la deconvolución iterativa pueden suprimir de manera efectiva el fondo desenfocado en iluminación hexagonal sin artefactos (Fig. S14), buscamos comprender la causa de esta discrepancia. Una hipótesis es que los artefactos se deben a una desalineación entre los focos de detección y excitación, como lo haría la hoja de luz que se desvía al pasar a través de regiones más gruesas de la muestra biológica. Nuestros datos simulados indican que tal desalineación podría conducir a un cambio axial en la PSF general e incluso puede causar artefactos estructurales de múltiples lóbulos si esta desalineación es particularmente severa (Figs. S15 y S16). Para probar si esto podría ocurrir en nuestras imágenes, medimos experimentalmente el cambio relativo entre los planos focales de excitación y detección utilizando perlas fluorescentes debajo de las células (Fig. S17, los detalles de las mediciones se describen en Métodos). La refracción entre el núcleo y el medio de cultivo celular puede dar como resultado un desplazamiento axial de hasta 500 nm en la parte inferior de la célula. Un cambio de esta magnitud alteraría la PSF general y podría generar artefactos en la imagen reconstruida. Estas mediciones sugieren que, en circunstancias en las que las compensaciones de la lámina de luz inducida por la muestra son insignificantes, por ejemplo, en muestras delgadas, muestras aclaradas ópticamente18, cuando se utilizan medios de cultivo celular de índice coincidente19, o cuando se combinan con óptica adaptativa para corregir estas aberraciones10, la luz de celosía hexagonal Se pueden aplicar láminas para mejorar la resolución axial sin generar artefactos en los lóbulos laterales. Sin embargo, se debe tener cuidado con los experimentos en los que se esperaría una desalineación significativa del haz inducida por la muestra.

Por último, tomamos imágenes de células IPSc vivas que se han editado con el gen CRISPR-Cas9 para expresar proteínas marcadas con fluorescencia a niveles endógenos para cuantificar los efectos de fotoblanqueo y fototoxicidad de las tres hojas de luz diferentes. A modo de comparación, ajustamos las intensidades de diferentes láminas de luz para que tuvieran la misma intensidad máxima o la misma intensidad integrada en una envolvente axial de 10 μm. Probamos condiciones de imagen de baja intensidad (~0,033 µW/µm2 en la muestra y pico de ~60 fotones de la muestra) y de alta intensidad (~0,1 µW/µm2 en la muestra y pico de ~240 fotones de la muestra) (detalle resultados que se muestran en la Fig. S18 y la Tabla S3). Obtuvimos imágenes iterativas de pilas 3D de células IPSc vivas que expresan α-tubulina-GFP durante 700 s a una velocidad de 0,14 Hz, y como se muestra en la Fig. S19, incluso a la intensidad más alta que probamos, observamos fotoblanqueamiento pero no fototoxicidad significativa en cualquiera de los tres tipos de haz evaluados mediante inspección visual de los cambios en la dinámica de los microtúbulos. Para comparar el fotoblanqueo, normalizamos la suma de las intensidades de píxeles en cada pila dentro del lapso de tiempo, lo representamos frente al tiempo y ajustamos esta curva con una caída exponencial (Fig. S20). Luego, el componente exponencial decreciente se ajusta a estos datos y se representa en la Fig. 5. Como se ilustra, cuando se obtienen imágenes con la misma intensidad máxima, el haz gaussiano tiene menos fotoblanqueo en comparación con las redes MB cuadradas y hexagonales (Fig. 5a, c), en nuestras mediciones de 100 volúmenes consecutivos, la fluorescencia residual de la muestra de la iluminación del haz gaussiano cae al 75 %, en comparación con el 69 % para la red cuadrada MB y el 62 % para la red hexagonal. Esto probablemente se deba al confinamiento más estricto en el perfil de excitación axial y la disminución de la dosis de luz total con iluminación gaussiana (eje derecho en la Fig. 5a, c). En la mayoría de los casos, las tasas de fotoblanqueo dependen en gran medida de la intensidad integrada, ya que las láminas de luz con la misma intensidad integrada comparten tasas de fotoblanqueo similares (Fig. 5b). Sin embargo, esto parece depender de la muestra y la intensidad, como se muestra en la Fig. 5d, cuando los microtúbulos se iluminan con haces de la misma intensidad integrada, el haz gaussiano se fotoblanquea significativamente más rápido, probablemente debido a su mayor intensidad máxima instantánea en comparación con MB-cuadrado. y redes hexagonales con la misma dosis total (eje derecho en la Fig. 5d).

a, b Constantes de decaimiento exponencial de fotoblanqueo para células iPSC que expresan fluorescentemente etiquetadas con α-tublina reflejadas por los tres haces diferentes. Se toman cinco celdas para cada condición. Los gráficos muestran la mediana (línea roja), los cuantiles 25 y 75 % (recuadro azul), el rango de datos (bigotes) y los valores atípicos (cruz roja). Los puntos verdes se trazan en el eje derecho secundario e indican la intensidad relativa integrada (o máxima) en comparación con la red MB-cuadrada cuando los tres haces comparten la misma intensidad relativa máxima (o integrada). c, d Comparaciones de fotoblanqueo similares a (a, b), pero adquiridas con intensidades de iluminación más altas ((∼0,033 µW/µm2 en la muestra para una SNR baja frente a ∼0,1 µW/µm2 en la muestra para una SNR alta).

En este documento, realizamos simulaciones y mediciones experimentales para caracterizar las compensaciones entre los diferentes patrones de haz utilizados en la microscopía de láminas de luz. Evaluamos el rendimiento del haz mediante comparaciones de FWHM en el espacio real, comparaciones de OTF en el espacio de frecuencia y FPC en imágenes simuladas con diferentes densidades de emisor y señal a ruido, y al obtener imágenes de varias estructuras subcelulares tanto en células vivas como fijas. Es importante destacar que realizamos estas mediciones no solo en el foco del haz, sino también en diferentes puntos a lo largo de la longitud de propagación del haz. En todos los casos, demostramos una clara mejora en la resolución axial y la uniformidad del haz a lo largo de la dirección de propagación para la red cuadrada MB y las redes hexagonales en comparación con los haces gaussianos o de parte superior plana. En un esfuerzo por ayudar a resolver los hallazgos contradictorios anteriores, describimos cómo se pueden optimizar los diferentes patrones de celosía para diferentes condiciones de imagen ajustándolos para que sean más gaussianos o de celosía.

La contrapartida de estas ventajas es que tanto las vigas MB cuadradas, las redes hexagonales y las vigas planas tienen una mayor excitación fuera del plano y una sección óptica reducida en comparación con las vigas gaussianas. En muestras densamente fluorescentes, esto da como resultado un aumento del ruido de disparo del fondo desenfocado, lo que provoca una reducción en la resolución lateral y da como resultado un aumento del fotoblanqueo en especímenes vivos. Para abordar esto, presentamos un método de iluminación de lámina de luz fusionada espectralmente. Al ponderar espectralmente y luego sumar dos imágenes secuenciales tomadas con láminas de luz que tienen la misma longitud y propiedades ópticas complementarias, este enfoque combina las ventajas de la iluminación de celosía cuadrada MB de fondo bajo y la iluminación de celosía hexagonal de alta resolución axial.

Al obtener imágenes de diferentes estructuras celulares, demostramos que el fotoblanqueo es complejo y puede depender no solo de la dosis total, sino también de forma no lineal de la intensidad instantánea, así como del microambiente químico local dentro de la célula. Para aplicaciones en las que la resolución y la uniformidad son menos importantes que el fotoblanqueo o si se requiere el uso de fluoróforos menos estables, entonces un haz gaussiano brindará la menor cantidad de iluminación a la muestra en comparación con los haces de celosía hexagonal, MB-cuadrada o de parte superior plana. de la misma longitud de propagación y la misma intensidad de pico. Alternativamente, si la resolución axial y la uniformidad del haz son importantes, entonces, para un haz de una longitud determinada, las redes MB cuadradas y hexagonales, o las imágenes fusionadas de ambas, capturarán más información de alta resolución de la muestra y resolverán las características que no serían visible con un haz gaussiano. Dependiendo de los requisitos experimentales, se pueden elegir diferentes láminas de luz de celosía para equilibrar estos factores.

Todas las comparaciones de resolución en este documento, perfiles FWHM, mediciones OTF y FPC, se realizan a partir de datos sin procesar sin deconvolución. Para todas las láminas de luz comparadas, estas imágenes se pueden procesar más a través de deconvolución lineal (p. ej., Wiener) o iterativa (p. ej., Richardson-Lucy (RL)) para corregir la respuesta del instrumento, incluido el perfil de la lámina de luz, y restaurar una imagen más estimación precisa de la verdadera estructura de la muestra. Demostramos que tanto la deconvolución lineal como la iterativa pueden eliminar el desenfoque fuera de foco para todas las láminas de luz probadas y, cuando se usan con el modelo PSF correcto, pueden restaurar con precisión imágenes sin artefactos de la muestra. Sin embargo, advertimos encarecidamente contra el uso de imágenes desconvolucionadas para la comparación de resolución cuantitativa. Varios parámetros definidos por el usuario pueden afectar la imagen restaurada y no es sencillo ajustar estos parámetros de manera imparcial. Por ejemplo, uno puede suponer ingenuamente que fijar el número de iteraciones en la deconvolución RL permitiría una comparación imparcial entre condiciones. Sin embargo, observamos que la desconvolución de RL converge a diferentes velocidades para diferentes perfiles de láminas ligeras (Fig. S21a). Por lo tanto, optamos por variar el número de iteraciones para cada imagen de modo que se logre una cantidad constante de convergencia en todas las condiciones. Para la deconvolución lineal de Wiener, elegimos mantener constante el parámetro de regularización de la relación ruido/señal (NSR), aunque observamos que el valor óptimo para esto puede depender tanto de la estructura de la muestra, el recuento de fotones y el perfil de la hoja de luz. Debido a estas preocupaciones, utilizamos solo datos sin procesar para comparaciones cuantitativas, lo que demuestra que la deconvolución no es necesaria para obtener la ganancia de resolución de la microscopía de lámina de luz de celosía.

Como nota general, también advertimos contra el uso exclusivo de métricas del espacio real, como informar el FWHM de un emisor puntual o el grosor del lóbulo de excitación principal para caracterizar la resolución. Tales caracterizaciones, aunque intuitivas para haces gaussianos, pueden depender mucho de la elección del umbral o corte para perfiles más complejos (Fig. S22). En nuestra opinión, una descripción completa de la resolución se caracteriza mejor en el espacio de frecuencia investigando el OTF o mediante métricas objetivas, que son compatibles con imágenes de muestras biológicas, como FPC. En resumen, esperamos que esta comparación permita a los futuros usuarios elegir la mejor hoja de luz para su aplicación biológica particular. La obtención de imágenes de especímenes biológicos es una tarea compleja y llena de matices. Ninguna herramienta de observación experimental está libre de compromisos, pero una discusión clara y equilibrada de las ventajas y desventajas de los diferentes perfiles de iluminación permitirá al usuario tomar una decisión informada en función de sus objetivos experimentales.

Simulamos el perfil de excitación de diferentes láminas de luz en la muestra definiendo primero el campo eléctrico complejo en la parte posterior de la pupila del objetivo de excitación. Para láminas de luz gaussianas y de parte superior plana, este complejo campo eléctrico se transforma y eleva al cuadrado de Fourier para simular el perfil de intensidad en el foco de la muestra. Para aproximar mejor el proceso experimental de formación de haces de redes cuadradas MB y redes hexagonales, introdujimos un paso intermedio mediante el cual el campo eléctrico complejo ideal en la pupila posterior se transforma en Fourier para simular el campo eléctrico ideal en el foco de la muestra. Luego tomamos solo el componente real de este campo ideal para simular el efecto del modulador de luz espacial (SLM) utilizado para generar estos haces experimentalmente (Fig. S23a). Debido a que el perfil de fase de campo eléctrico ideal en la muestra es cero o Pi, este enfoque es válido ya sea que se use un SLM binario o en escala de grises para manipular la fase del frente de onda reflejado y generar patrones de celosía experimentalmente. Luego, esta imagen SLM se transforma de Fourier inversa (Fig. S23b) y se filtra mediante una máscara anular con una combinación de NA interna y externa deseada para bloquear el componente de CC y pasar selectivamente el primer orden de difracción (Fig. S23c, d). Finalmente, este campo eléctrico complejo filtrado se transforma por última vez en Fourier y se eleva al cuadrado para simular el perfil de intensidad en el foco de la muestra (Fig. S23f). Estos pasos son para simular la trayectoria de la luz en el microscopio de hoja de luz de celosía donde la hoja de luz se refleja en un SLM y luego se filtra por una máscara en un plano de pupila conjugada. Dichos pasos se omiten para la simulación de láminas de luz gaussianas, ya que no pasa por el SLM y la máscara. Para simular el perfil de excitación en diferentes ubicaciones a lo largo de la longitud de propagación del haz en la muestra, agregamos un perfil de fase de desenfoque complejo \({{{{{\rm{exp}}}}}}(2\pi{i}{k }_{y}\times{y})\) al campo de la pupila antes de la transformada de Fourier siguiendo los métodos de Hanser et al., donde y denota la distancia desde el foco del haz, y \({k}_{y }=\sqrt{1-({{k}_{x}}^{2}+{{k}_{z}}^{2})}\), es la proyección del vector de onda en la pupila a lo largo de la dirección de propagación del haz20.

Definimos un haz gaussiano por un campo eléctrico de valor real con un perfil de amplitud gaussiana centrado en el origen y extendido a lo largo de la línea kx = 0 en el plano de la pupila. Definimos la apertura numérica (NA) de una hoja de luz gaussiana como el valor en el que la amplitud de la pupila cae a 1/e del pico gaussiano central, con su campo eléctrico en la pupila trasera siguiendo un perfil de \({E}= {E}_{0}\times {{{{{\rm{exp }}}}}}(-{(\frac{{k}_{z}}{{{{{{{\rm{NA }}}}}}}})}^{2})\). Definimos haces de superficie plana de manera similar como un campo eléctrico de valor real de amplitud constante a lo largo de la línea kx = 0 con un NA de corte en la parte posterior de la pupila (Fig. S24a). Las láminas de luz de celosía cuadrada se pueden generar como el patrón de interferencia de una matriz coherente de haces de Bessel-Gauss con un espacio definido en el eje x en el plano de la muestra o como el patrón de interferencia coherente de cuatro haces centrados en una AN dada en la pupila posterior. y posicionado a 0, 90, 180 y 270 grados con respecto a la línea kx = 0 (Fig. S24b). El trabajo anterior ha demostrado que las redes cuadradas MB son equivalentes a un subconjunto de posibles láminas de luz de celosía cuadrada en las que cada haz tiene un perfil de intensidad constante a lo largo de la dirección kz2. Para este trabajo, simulamos redes MB-cuadradas definiendo primero el \(\Delta {{{{{{\rm{NA}}}}}}}\) de la máscara anular. A continuación, se generaron cuatro haces de luz de valor real en la pupila trasera. Los haces de 0 y 180 grados se centraron lateralmente en la línea kx = 0 y los de 90 y 270 grados se centraron axialmente en la línea kz = 0. La posición kx de los haces de 90 y 270 grados estará determinada por la muestra. espaciamiento plano de los haces de Bessel coherentes o se puede establecer directamente en el plano de la pupila. A menos que se indique lo contrario y como se hizo anteriormente2, configuramos la posición kx de los haces de luz de 90 y 270 grados para que queden justo fuera del anillo interior de la máscara. Luego, cada uno de los cuatro haces se extendió a lo largo de la dirección kz para tener una amplitud de valor real constante que fue recortada por el corte de la máscara anular. Esta configuración particular logra una constante \({\varDelta k}_{y}=\sqrt{\left(1-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}}^{2}\right)}-\sqrt{\left(1-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\max }}}}^ {2}\right)}\) en la superficie curva de la pupila entre los cuatro haces. En esta condición, después de la transformación de Fourier a la muestra, el campo eléctrico aportado por los cuatro haces tendrá una longitud de propagación igual en la muestra, lo que dará como resultado el haz con la mayor invariancia de propagación. Las redes hexagonales se generan centrando seis haces en \({{{{{\rm{NA}}}}}}=\frac{{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{ {\max }}}+{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}}{2}\), donde NAmax y NAmin son la NA exterior e interior en el plano de la pupila. El campo eléctrico de cada punto de la pupila se extiende a un perfil gaussiano, con \(E=\,{E}_{0}\times {{{{{\rm{exp }}}}}}(-{ (\frac{{k}_{z}}{\triangle {k}_{z}})}^{2})\). Donde \({\triángulo k}_{z}={{{{{\rm{FC}}}}}}\cdot \left({{{{{{\rm{NA}}}}}}} _{{{\max }}}-{{{{{{\rm{NA}}}}}}}_{{{\min }}}\right)\), y FC es el factor de relleno que es establecido en 1 en nuestra simulación (Fig. S24c). Para simular el difuminado experimental para generar un perfil de iluminación homogéneo en la muestra, el perfil de intensidad en la muestra se promedia a lo largo de la dirección x para generar la PSF de excitación final. El PSF de detección se simula siguiendo las integrales de campo anular de Richards y Wolf con NA = 1.0 y un índice de 1.3321, luego el PSF general se calcula como el producto de píxeles de los PSF de excitación y detección. La OTF global es la transformada de Fourier de la PSF global.

Para caracterizar nuestros PSF simulados, calculamos su medio máximo de ancho completo (FWHM) en el PSF general, su rango de soporte OTF y su sección óptica (Tabla S2). Calculamos la iluminación FWHM usando la función "findpeaks" en matlab (Mathworks) en función del perfil axial general de los PSF. Esta función define la mitad del valor máximo usando la prominencia del pico, que para los patrones axialmente simétricos usados ​​aquí, se define como el 50 % del valor entre el pico central y el valor mínimo de iluminación dentro de ±10λ (Fig. S22). El rango de soporte de OTF se calcula como el rango de frecuencia donde la amplitud de OTF cae al 0,1 % del valor de CC, y la sección óptica se calcula en función de la mitad del ancho dentro del cual cae el 63 % de la intensidad acumulada (igual que Remacha et al. 11). Para comparar nuestra caracterización con los resultados publicados anteriormente, también seguimos a Remacha et al. y calculó el ancho del lóbulo principal en el perfil de excitación, la sección óptica y la longitud de propagación en función de la sección óptica. Sin embargo, en nuestro caso, definimos el ancho del lóbulo principal como el ancho donde la intensidad cae al 63% del pico. Tenga en cuenta que este es un umbral diferente del utilizado en Remacha et al. (37%). Descubrimos que el uso de un umbral del 37% hizo que las gráficas sobrestimaran drásticamente el ancho del pico axial central debido a las redes hexagonales y cuadradas MB debido a los lóbulos laterales en la excitación (Fig. S22). En general, esta discrepancia ilustra los desafíos de usar un solo parámetro (p. ej., una intensidad de corte) para definir haces no gaussianos, por lo que favorecemos el uso de métricas más objetivas, como comparar el OTF de cada haz a lo largo de la longitud de propagación. Finalmente, también comparamos la longitud de propagación del haz definida usando la intensidad FWHM, como usamos aquí, y definida usando la distancia donde el corte óptico se duplica como en Remacha et al. y muestran que estos proporcionan estimaciones muy similares de la longitud del haz (Tabla S1).

Simulamos las condiciones de imagen en volúmenes 3D de perlas fluorescentes de la siguiente manera. Primero se genera un volumen 3D de puntos distribuidos aleatoriamente a una densidad definida como la imagen real del suelo y luego se convoluciona con el PSF general simulado (detección + excitación) de diferentes hojas de luz. Para una imagen determinada, se utiliza una única PSF general para convolucionar todo el volumen 3D sin tener en cuenta la variación de la PSF a lo largo de la dirección de propagación. Por lo tanto, para la imagen simulada en el centro de propagación del haz, se usa la PSF total en el centro del haz, y de manera similar para la imagen simulada en el FWHM de la propagación del haz. Para simular la autofluorescencia, se agrega un piso de ruido gaussiano constante en la imagen real del suelo antes de la convolución PSF. Para modelar con precisión el ruido de disparo, se agrega ruido de Poisson independiente a cada píxel tanto del PSF antes de la convolución como a la imagen simulada después de la convolución. Para evitar la introducción de correlaciones espurias en las imágenes simuladas, el ruido de Poisson se muestrea de forma independiente para cada imagen y par de PSF. Para cuantificar la resolución axial y lateral, adoptamos FPC como se describe en Nieuwenhuizen et al.13 en dos imágenes 3D simuladas generadas con la misma realidad del terreno y PSF, cada una con ruido de Poisson independiente. En el gráfico FPC, el vector que conecta cada píxel con el origen define un plano en el espacio de Fourier, en el que el coeficiente de correlación entre las dos imágenes se asigna a la intensidad de ese píxel. Promediamos el plano FPC en kx = 0 y ky = 0, luego calculamos el área donde el valor FPC es mayor que 1/7 como cuantificación de la resolución general de la imagen.

Obtuvimos imágenes de perlas fluorescentes y células fijas a temperatura ambiente en solución salina tamponada con fosfato (Corning, artículo n.º 46013CM). Obtuvimos imágenes de células vivas a 37 °C en CO2 al 5 % en Flurobrite (Thermo Fisher, A1896701) + suero bovino fetal (FBS, VWR: 1500-050) + penicilina-estreptomicina (Gibco 15140-122). Todas las mediciones se adquirieron en una versión modificada del instrumento descrito en Chen et al.2 Las modificaciones clave relevantes para este trabajo son el uso de un SLM en escala de grises (Meadowlark P1920-0635-HDMI), una lente de excitación 0.6 NA (Thorlabs, TL20X- MPL) y una lente de detección 1.0 NA (Zeiss, Objective W "Plan-Apochromat" × 20/1.0, modelo n.° 421452-9800) (Fig. 1a). Para proporcionar una comparación equilibrada, ajustamos la intensidad de todas las láminas de luz traduciendo axialmente cada patrón de excitación en un rango axial de 10 µm con un tamaño de paso de 100 nm en relación con una sola perla fluorescente roja de 100 nm de diámetro (excitación de 580 nm/605 nm/ longitud de onda de emisión, Thermo Fisher, F8801). A menos que se indique lo contrario, todas las láminas de luz se escalaron para tener la misma intensidad máxima en la muestra. Para lograr esto, medimos la intensidad relativa de la hoja de luz trazando la emisión integrada de la perla en cada posición de la hoja de luz y luego ajustamos la configuración de un filtro sintonizable acústico-óptico para lograr la misma intensidad máxima o la misma intensidad integrada (donde se indica). ) para cada hoja de luz diferente. Para estimar la potencia promedio en la muestra para cada una de las diferentes hojas de luz, dividimos la potencia total medida en la pupila de entrada del objetivo de excitación por un área determinada por el ancho de la hoja de luz (w) y la altura axial para cada haz en el que 90 Se contuvo el % de la energía del haz (h90) (Fig. S18 y Tabla S3). Tomamos imágenes de muestras biológicas escaneando lateralmente la platina de muestra a través de la hoja de luz con un tamaño de paso de 200 nm (107 nm en cada paso a lo largo de la dirección axial del objetivo de detección, dado que hay un ángulo de 57,6 grados entre el movimiento de la platina de muestra y el eje óptico del objetivo de detección, o de manera equivalente, un ángulo de 32,4 grados entre el plano de formación de imágenes del objetivo de detección y el movimiento de la platina de muestra). Para el análisis FPC, adquirimos dos imágenes con una exposición de 20 ms en cada posición antes de mover el escenario. A continuación, se tomaron imágenes secuencialmente de la misma región de interés con cada tipo diferente de hoja de luz.

Para las imágenes simuladas y biológicas, aplicamos la deconvolución de Richard-Lucy con el correspondiente PSF general medido experimentalmente para cada hoja de luz. Debido a que las pilas de imágenes sin procesar tomadas experimentalmente están sesgadas debido al ángulo entre la detección y las coordenadas de la muestra, las imágenes experimentales sin procesar primero se desvían antes de restarles el fondo utilizando el valor promedio de la corriente oscura de la cámara. Después de la resta de la corriente oscura, los píxeles negativos se recortan a cero y se aplica la deconvolución RL a las imágenes desviadas con la función integrada de Matlab (Mathworks) "deconvlucy". Para compensar la diferencia en la tasa de convergencia de diferentes patrones de láminas de luz (Fig. S21a) y para evitar aumentar el ruido en las imágenes al extrapolar más allá del soporte OTF (Fig. S21b), aplicamos iterativamente la deconvolución RL hasta la raíz cuadrada media por píxeles. la diferencia entre iteraciones vecinas cae por debajo del 25% de la primera iteración. Por lo tanto, usamos diferentes números de iteraciones al desconvolucionar imágenes para diferentes hojas de luz, pero nos aseguramos de que cada condición final alcanzara el mismo grado de convergencia. Para la deconvolución de Wiener, aplicamos la función integrada de Matlab "deconvwnr" con NSR 0.005 para todas las condiciones.

Cultivamos células COS7 que expresan un plásmido 22 de histona H2B-HaloTag integrado de forma estable (obsequio de Tim Brown en Janelia Research Campus, RRID:CVCL_0224) en medio Eagle modificado de Dulbecco (Gibco 11965-092) con 10 % de FBS (VWR: 1500-050) y 1% (v/v) 10.000 U/ml Penicilina-Estreptomicina (Gibco 15140-122). Obtuvimos células iPSC (adquiridas en el Instituto Coriell para la Investigación Médica, RRID:CVCL_IR34) de las líneas celulares de la colección de células Allen (TUBA etiquetada con mEGFP monoalélica, AICS-0012) y las cultivamos en medios basales con el suplemento 5x provisto con un proporción de 4:1 (STEMCELL Technologies 85850_c) y 1% (v/v) 5000 U/ml Penicilina/Sreptomicina (Gibco 15070-063). Para imágenes de células fijas, incubamos COS7 con naranja mitotracker 250 nM (Thermo Fisher, M7510) en medios de cultivo para tinción de mitocondrias o JF549 250 nM en medios de cultivo para tinción de histonas durante 30 min. Luego fijamos las células con paraformaldehído al 4 % (Electron Microscopy Sciences, 15710) y sacarosa 8 nM/ml (Sigma, S7903) en tampón de citoesqueleto (compuesto por MES 10 mM, KCl 138 mM, MgCl 3 mM y EGTA 2 mM) durante 20 min a temperatura ambiente. Para la tinción de actina, permeabilizamos las células en Triton-X al 0,2 % (VWR Life Science, 0694) durante 10 min, luego las bloqueamos con albúmina sérica bovina al 2 % (Sigma, A9418) y Triton-X al 0,1 % durante 10 min antes de teñirlas con faloidina. 555 (Thermo Fisher, A34055) durante 20 min.

La fusión de múltiples vistas de las imágenes de diferentes hojas de luz se realiza en el espacio de frecuencia. Primero, Fourier transformó las imágenes del espacio real tomadas con las láminas de luz de celosía hexagonal y cuadrada MB en espacio de frecuencia y las normalizó por su amplitud en DC. La imagen de fusión multivista en el espacio de frecuencias se calcula luego como la suma ponderada con pesos determinados por la fuerza OTF relativa de cada patrón: \({\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{fusion}} }}}}}=\,{\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}\frac{{O}_{{{{{{\rm{hex }}}}}}}}{{O}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}+{O}_{{{{{{\rm{MB}}}}} }}}+{\widetilde{I}}_{{{{{\rm{MB}}}}}}}\frac{{O}_{{{{{{\rm{MB}}}} }}}}{{O}_{{{{{{\rm{hex}}}}}}}+{O}_{{{{{{\rm{MB}}}}}}}\ ), donde \(\widetilde{I}\) indica la transformada de Fourier de la imagen y O indica la OTF. \({\widetilde{I}}_{{{{{{\rm{fusion}}}}}}}\) es luego transformada de Fourier inversa en espacio real para generar la imagen de fusión multivista. Descubrimos que esta fusión de imágenes con ponderación de frecuencia equilibra mejor la señal y el ruido en cada componente de frecuencia de los diferentes patrones de láminas de luz y da como resultado un OTF final más suave que la simple suma de imágenes.

Para medir el grado en que se desvía una hoja de luz cuando se obtienen imágenes a través de muestras biológicas, cultivamos células COS7 en un cubreobjetos que había sido recubierto previamente con perlas fluorescentes rojas de 100 nm de diámetro y luego se fijaron y tiñeron con faloidina Alexa 488. Para medir el desplazamiento de la hoja de luz debajo de la muestra, en una posición determinada del escenario, primero escaneamos axialmente el perfil de excitación en relación con el plano focal de detección y trazamos la señal de fluorescencia integrada de una región pequeña (3 píxeles) alrededor de cada cuenta en el campo de vista. El pico de esta gráfica define el centro del perfil de excitación en relación con la posición de cada perla debajo de la muestra. Luego, determinamos la posición de cada cuenta en relación con el plano focal del objetivo de detección escaneando el cubreobjetos junto con la iluminación de la hoja de luz a lo largo del eje óptico del objetivo de detección (equivalente a la iluminación de campo amplio). El desplazamiento del patrón de excitación con respecto al plano focal del objetivo de detección se calcula luego a partir de estos gráficos comparando las posiciones de la hoja de luz con respecto a la perla y la posición de la perla con respecto al plano focal.

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. Para comparar los tipos de haces en conjuntos de datos de celdas fijas, los experimentos se repitieron dos veces con tres celdas en cada ensayo. Se muestran imágenes representativas de una sola celda; todas las celdas muestran la misma tendencia. Para las pruebas de fotoblanqueo y fototoxicidad de células vivas, se recolectaron cinco células de un solo ensayo. Todas las celdas del ensayo muestran la misma tendencia. Los datos agregados se representan en la Fig. 5. No se excluyeron datos de los análisis. Los experimentos no fueron aleatorios. Los investigadores no estaban cegados a la asignación durante los experimentos y la evaluación de resultados.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los conjuntos de datos subyacentes a las Figs. 1–3 se pueden regenerar a partir del código fuente que está disponible como se describe a continuación. Debido a las limitaciones de tamaño, los conjuntos de datos subyacentes a las Figs. 4 y 5 y todas las figuras complementarias (excluyendo aquellas que pueden generarse a partir del código fuente) están disponibles gratuitamente a pedido del autor correspondiente. En la medida de lo posible, los autores intentarán cumplir con todas las solicitudes de intercambio de datos dentro de las 2 semanas posteriores a la solicitud original. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

El código fuente generado y/o analizado durante el estudio actual está disponible en: https://github.com/legantlab/Shi_et_al_Nat_Comm_SourceCode. El código se proporciona bajo la Licencia MIT para software de código abierto, una licencia permisiva aprobada por la Iniciativa de código abierto. Los términos específicos se pueden encontrar aquí: https://opensource.org/licenses/MIT.

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Artículo Google Académico

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Damos las gracias al Dr. Eric Betzig útil para los debates y para proporcionar una parte del código utilizado para simulaciones ópticas. También agradecemos al Dr. Daniel Milkie por su ayuda con el software de control para ejecutar el microscopio de hoja de luz de celosía en este trabajo. Este trabajo fue financiado en parte por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (1DP2GM136653) otorgadas a WRLWRL reconoce el apoyo adicional del programa Searle Scholars, el Programa Beckman Young Investigator y la Beca Packard para Ciencias e Ingeniería.

Departamento Conjunto de Ingeniería Biomédica, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Universidad Estatal de Carolina del Norte, Chapel Hill, NC, 27599, EE. UU.

Tú Shi y Wesley R. Legant

Departamento de Farmacología, Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, Chapel Hill, NC, 27599, EE. UU.

Timothy A. Daugird y Wesley R. Legant

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YS y WRL concibieron el proyecto y diseñaron los estudios. YS realizó las simulaciones, mediciones experimentales y análisis de datos. YS y TAD prepararon muestras utilizadas para mediciones experimentales. YS y WRL escribieron el manuscrito con comentarios de todos los autores. WRL supervisó y dirigió el proyecto.

Correspondencia a Wesley R. Legant.

WRL es autor de patentes relacionadas con la microscopía de hoja de luz de celosía y sus aplicaciones, que incluyen: Números de patente de EE. UU.: US 11,221,476 B2 y US 10,795,144 B2 otorgadas a WRL y coautores y asignadas al Instituto Médico Howard Hughes. YS y TAD no declaran intereses en conflicto.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Shi, Y., Daugird, TA & Legant, WR Un análisis cuantitativo de varios patrones aplicados en microscopía de lámina de luz de celosía. Nat Comun 13, 4607 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32341-w

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Recibido: 18 mayo 2022

Aceptado: 26 julio 2022

Publicado: 08 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32341-w

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